[發明專利]一種檢測去甲氯胺酮的ELISA測試盒及制備方法

無效

• 申請號: 200910184032.0
• 申請日: 2009-08-11
• 公開（公告）號: CN101620231A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發明（設計）人: 趙曉聯;趙春城;楊婷婷;沈笑平;魏萬里;何金海;蔡建榮;龔燕;蔡正森;吳杰;沈雯琰;王文靜;張海濤
• 申請（專利權）人: 江蘇省蘇微微生物研究有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/64;G01N33/535;G01N33/543;C12N15/06;C12P21/08
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1、一種檢測去甲氯胺酮(NKET)的ELISA測試盒，其包括洗滌液、顯色液A、顯色液B和終止液，其特征在于：其還包括包被板、去甲氯胺酮(NKET)標準品、抗NKET單克隆抗體和酶標記的羊抗鼠抗體凍干品。

2、一種檢測去甲氯胺酮(NKET)的ELISA測試盒的制備：其特征在于：其包括以下步驟，包被板的制備、去甲氯胺酮(NKET)標準品的制備、抗NKET單克隆抗體的制備和酶標記的羊抗鼠抗體凍干品的制備。

3、根據權利要求2所述一種檢測去甲氯胺酮的ELISA測試盒的制備：其特征在于：所述包被板包被固相抗原，其可采用96或48或24孔微孔板，用10～100mmol/L?pH9～10Na₂CO₃-NaHCO₃的緩沖液作為包被液，去甲氯胺酮-卵清蛋白(NKET-OVA)稀釋至0.1μg/m?L～1.0μg/m?L，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2～8℃放置過夜，棄去包被液，洗滌2～5次，按加入含1～5％牛血清白蛋白，pH?7～8的磷酸鹽緩沖液，2～8℃封閉過夜，棄去封閉液，吹干，板條密封后置-20～-40℃冷凍保存；

4、根據權利要求2所述一種檢測去甲氯胺酮的ELISA測試盒的制備：其特征在于：所述去甲氯胺酮標準品從去甲氯胺酮純品中稀釋得到，稀釋液為去離子水，NKET濃度為：0ng/mL～100ng/mL。

5、根據權利要求2所述一種檢測去甲氯胺酮的ELISA測試盒的制備：其特征在于，所述抗NKET單克隆抗體的制備：50μgNKET-BSA偶聯抗原用50μl生理鹽水配成1μg/μl抗原溶液，與等體積完全福氏佐劑(液體石蠟∶羊毛脂∶卡介苗＝12g∶20ml∶0.105g)混勻，充分乳化，供首次免疫用。加強免疫時用同量的不完全福氏佐劑(液體石蠟∶羊毛脂＝12g∶20m1)代替完全福氏佐劑。首次免疫采用小鼠腹腔內直接注射，免疫劑量為50μg/只小鼠。以后每隔2周加強免疫一次，加強免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量10μg/只。最后一次免疫采用脾內注射，4天后取脾融合。將分離的免疫小鼠脾細胞與處于對數生長期的骨髓瘤細胞SP-2/o以10∶1比例混合。離心，去除上清。在50～90S內將1ml?50％聚乙二醇(分子量為1500)加至細胞中，充分混勻，使其融合，1min后加入20ml?DEM培養液，終止融合。水浴靜止10min后離心，去除上清。將融合細胞用含20％小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮后，以最后濃度為1×10⁴飼養細胞/0.1ml接種于以小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中，于5％CO₂，37℃條件下培養，8d后，每培養孔更換2/3HT培養液。10d～20d后，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔，取上清液進行篩選，對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆。雜交瘤篩選采用固相抗原間接非競爭ELISA法進行。以NKET-OVA為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽性對照，以SP-2/o骨髓瘤細胞培養的上清液為陰性對照。陽性細胞孔的判定標準為(A_試驗-A_空白)/(A_對照-A_空白)＞2.1。對分泌陽性抗體的細胞進行克隆。采用有限稀釋法，將陽性克隆細胞吹勻，取一微滴至培養瓶內，倒置顯微鏡下準確計數細胞個數，稀釋為70個/ml再取1ml稀釋20倍，接種入96孔培養板中進行亞克隆。直至所有細胞孔的培養上清均呈陽性為止。對10～13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3～0.5ml/只，8～10d后，腹腔注射培養至對數期的雜交瘤細胞，5×10⁵細胞/只。5d后注意觀察，收集腹水，離心去除沉淀，加甘油于-20℃保存。