[發明專利]Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200910182571.0
• 申請日: 2009-09-16
• 公開（公告）號: CN101665834A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 鄭駿年;顧峰;裴冬生;馬萍;陳菲菲;底潔卉;張寶福;徐為;李望
• 申請（專利權）人: 鄭駿年
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所
• 代理人: 周愛芳

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體是一種Ki67mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測 試劑盒。通過逆轉錄(RT)樣品mRNA得到cDNA，再結合實時熒光定量PCR 檢測技術，精確定量檢測標本中人Ki67mRNA表達量的試劑盒。

背景技術

惡性腫瘤轉移是臨床治療的一大難題，也是惡性腫瘤致死的一個重要原因。 能否及早發現轉移并作出診斷，對腫瘤患者的預后判斷、治療方案制定、生存率 提高，以及醫療衛生事業的發展均有重要的意義。

目前，腫瘤轉移的診斷主要依靠影像學(如X光片、CT、磁共振、PET等) 和病理學檢查。但影像學檢查發現的病灶，通常要達到一定大小才能夠被儀器分 辨，且無法定性。而通過病理形態判斷細胞惡變與否，則一定要取到合適的檢測 標本，且要具有相當數量的可觀察到的腫瘤細胞存在。因此，影像學和病理學檢 查均難以在腫瘤轉移的早期實現準確診斷。

研究表明，血行轉移是腫瘤擴散的主要途徑之一，因此在患者外周血中進行 腫瘤細胞的基因表達檢測是了解腫瘤轉移的有效方法。但是腫瘤轉移早期，血液 中的腫瘤細胞數量極少，因此外周血中微量腫瘤細胞檢測，必須滿足高靈敏度的 檢測方法和特異性的腫瘤生物學標記2個條件，才能從血液大量的細胞中檢測到 極其微量的腫瘤細胞，從而達到早期診斷目的。

1983年Mullis發明了聚合酶鏈式反應(PCR)。由于該項技術具有簡便快速、 特異性和靈敏度高、重復性好等突出優點，因此被廣泛應用于基礎研究和臨床診 斷。1991年Smith等首次應用PCR技術檢測到血循環中存在轉移的癌細胞，其 后PCR技術被廣泛用于微轉移研究。近年來，RT-PCR法已被用于淋巴結、血液 中微量癌細胞特殊mRNA檢測，并顯示出較高的靈敏性，是目前微轉移檢測有 效的方法之一。使用較多的還有巢式PCR(nest-PCR)，它是使用兩套以上的引物 進行擴增，目的在于增高DNA的特異性。應用巢式PCR檢測技術已能夠在外周 血、淋巴結或骨髓中早期測定出數量很少的循環癌細胞。但是這些傳統PCR技 術在應用中存在著不能對腫瘤細胞特殊mRNA進行準確定量，以及操作過程中 易污染而使得假陽性率高等缺點，因此不能夠滿足實際工作需要，使其應用受到 限制。隨著Taqman實時熒光定量PCR技術的出現，人們可以真正做到對PCR 樣本中微量mRNA的精確定量，而且由于特異性熒光探針雜交技術的應用，使 得被檢測基因的特異性大大提高。

Taqman實時熒光定量RT-PCR技術是1996年美國PE公司發明的一種高靈 敏度PCR試驗方法。其技術原理是在PCR的反應體系中加入一條帶有雙熒光標 記的探針，該探針能與模板核酸發生特異性雜交。探針的5’端標記熒光報告基 團FAM(6-羧基熒光素，熒光發射值在518nm處)，3’端標記熒光淬滅基團 TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明，熒光發射值在582nm處)。探針結構完整時，5’ 端FAM所發出的熒光被3’端TAMRA所吸收，不出現熒光信號的變化。隨著 PCR反應的進行，當合成的新鏈移動到探針結合的位置時，Taq聚合酶將探針切 斷，探針的完整性遭到破壞，3’端的淬滅作用被解除，5’端的FAM熒光信號 被釋放出來。PCR每復制一個核苷酸片段，就有一個探針被切斷，同時一個熒 光信號被釋放出來，產物與熒光信號產生一對一的對應關系。隨著產物的增加， 熒光信號亦隨之增強，當信號增強到某一閾值時(根據熒光信號基線的平均值和 平均標準差，計算出99.7％的置信度大于平均值的熒光值，即為閾值)，此時的 循環次數即循環閾值Ct(cycle?threshold，Ct)被記錄下來。該循環參數Ct和PCR 體系中起始模板數的對數之間有嚴格的線性關系。利用不同梯度的陽性定量標準 模板擴增的Ct值和該陽性定量標準的模板數經過對數擬合制成標準曲線，再根 據待測樣品的Ct值就可以準確的確定起始模板的數量，因此根據PCR產物的熒 光強度即可計算出初始模板的數量。實時熒光定量PCR具有特異性強、靈敏度 高、定量準確、操作安全等優點，使用該方法擴增腫瘤組織特異性mRNA來檢 測微轉移，是一種高靈敏度、高特異性、操作簡便的方法，現已在檢測外周血微 量腫瘤細胞中嘗試。