[發(fā)明專利]一種制備枯草芽孢桿菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910175148.8
• 申請(qǐng)日: 2009-09-23
• 公開（公告）號(hào): CN101654665A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉國(guó)忠;張潔巖;劉勇;李新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南利蒙特生物農(nóng)藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A01P3/00;C12R1/125
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 逯長(zhǎng)明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種制備枯草芽孢桿菌的方法。

背景技術(shù)

世界范圍每年全世界要生產(chǎn)農(nóng)藥200多萬噸，其主要是化學(xué)農(nóng)藥，長(zhǎng)期 使用化學(xué)農(nóng)藥，病原物和害蟲易產(chǎn)生抗藥性，有些化學(xué)農(nóng)藥已被證實(shí)有致癌、 致畸、致突變的問題，同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥殘留也制約著農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量。

近年來，生物農(nóng)藥迅速崛起。生物農(nóng)藥是指以細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲 以及由它們產(chǎn)生的代謝物(農(nóng)用抗生素)為有效成分的農(nóng)藥，生物農(nóng)藥起源于 1960年代，其開發(fā)在1970年代曾掀起過高潮，但由于當(dāng)時(shí)生物技術(shù)、手段、 水平相對(duì)較低，生物農(nóng)藥本身對(duì)工藝、貯藏、運(yùn)輸要求又高，及隨后擬除蟲 菊酯的崛起造成生物農(nóng)藥的開發(fā)步入低潮。近年來，隨著人類對(duì)生存環(huán)境質(zhì) 量的要求越來越高，無公害、無污染、無殘留、成本低、且不易產(chǎn)生抗性的 生物農(nóng)藥又重新受到關(guān)注。生物技術(shù)尤其是微生物技術(shù)的進(jìn)步更為這類農(nóng)藥 的開發(fā)提供了便利。目前生物農(nóng)藥銷售額達(dá)$3億，約占整個(gè)農(nóng)藥市場(chǎng)的1％， 且年產(chǎn)值每年上升10％～20％。

其中，微生物農(nóng)藥是公認(rèn)的“無公害農(nóng)藥”，防治對(duì)象不易產(chǎn)生抗藥性、 不傷害天敵，繁殖快，是綜合防治農(nóng)林病蟲害的主要手段。隨著全球化學(xué)農(nóng) 藥公害問題日趨嚴(yán)重，近年來的微生物農(nóng)藥研究備受重視。對(duì)枯草芽孢桿菌 的研究應(yīng)用也成熱點(diǎn)。

枯草芽孢桿菌，英文名(Bacillus?subtilis)，是芽孢桿菌屬的一種。 因廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。它通過 營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖從而占據(jù)生存空間的方式來阻止植物病原菌的生長(zhǎng)， 能在植物表面迅速形成一層高密保護(hù)膜，使病原菌得不到生存空間，從而保 護(hù)作物免受病原菌危害；枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多 粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，抑制病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)， 從而達(dá)到預(yù)防與治療的目的。可用于果蔬病害、白粉病、灰霉病、水稻稻瘟 病、香蕉葉斑病、橡膠樹白粉病和炭疽病等多種作物種傳和土傳病害。因該 制劑防病機(jī)理獨(dú)特，以菌治菌，所以可用于多種作物病害的防治，均收到優(yōu) 異的效果。

目前，市場(chǎng)上常見的是枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，多用常規(guī)發(fā)酵方法如 液體深度發(fā)酵制備，即只采用液體培養(yǎng)基對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，之后經(jīng)過 過濾、干燥等工藝得到枯草芽孢桿菌母粉，其含枯草芽孢桿菌孢子數(shù)大多為 200億個(gè)活芽孢/克，用于防治農(nóng)作物病蟲害用量大，成本高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)制備的枯草芽孢桿菌可濕性粉劑中孢子數(shù)太少的 缺陷，提出一種新的制備枯草芽孢桿菌的方法。該方法制備的枯草芽孢桿菌 孢子數(shù)可達(dá)1×10¹¹個(gè)活芽孢/克以上。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種制備枯草芽孢桿菌的方法，包括以下步驟：

步驟1：將第一液體培養(yǎng)基調(diào)pH值為6.5～7.5，高溫滅菌后冷卻至室溫， 接種活化的枯草芽孢桿菌菌種，培養(yǎng)20～40小時(shí)，得液體菌種備用；

步驟2：將第二液體培養(yǎng)基高溫滅菌后冷卻至室溫，按培養(yǎng)基體積的3％ 接種步驟1所得液體菌種，攪拌并通氣，在無菌狀態(tài)培養(yǎng)24～35小時(shí)，得種 子液備用；

步驟3：將麩皮60％-70％、稻草粉20％-30％、玉米粉10％-20％混合均勻配 制成固體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫滅菌后，降溫至室溫，在無菌狀態(tài)接種步驟2所得 種子液并進(jìn)行培養(yǎng)；

步驟4：將步驟3的培養(yǎng)基在無菌狀態(tài)進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)72～90小時(shí)， 干燥后，即得到本發(fā)明所述高濃度枯草芽孢桿菌。

步驟1所述第一液體培養(yǎng)基優(yōu)選為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基或牛肉汁蛋白胨培 養(yǎng)基，步驟1中最佳培養(yǎng)溫度為28～30℃。

步驟2所述通氣的通氣量?jī)?yōu)選為1∶1。

步驟2所述第二液體培養(yǎng)基為培養(yǎng)細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)基，如玉米粉大豆粉 培養(yǎng)基或玉米粉大豆粉葡萄糖培養(yǎng)基，所述玉米粉大豆粉培養(yǎng)基中玉米粉與 大豆粉重量比1∶2-3，所述玉米粉大豆粉葡萄糖培養(yǎng)基中玉米粉∶大豆粉∶ 葡萄糖的重量比為1∶2∶1。

步驟2中接種濃度優(yōu)選為0.6×10⁹個(gè)芽孢/毫升。

步驟2中最佳培養(yǎng)pH值為7.5～8.5。

步驟3的接種量?jī)?yōu)選為培養(yǎng)基重量的3％～10％。

步驟4所述干燥優(yōu)選在室溫或低溫進(jìn)行。