[發明專利]遲緩愛德華菌弱毒菌株及應用

有效

• 申請號: 200910164591.5
• 申請日: 2009-07-17
• 公開（公告）號: CN101705198A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 莫照蘭;李杰;茅云翔;肖鵬;楊佳銀;王波
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及水產養殖動物病害防治技術，具體的說是防治遲緩愛德華 菌(Edwardsiella?tarda)感染的遲緩愛德華菌弱毒菌株及應用。

技術背景

遲緩愛德華菌是一種革蘭氏陰性致病菌，感染宿主范圍廣，可以感染 多種低等和高等動物。在水產養殖動物中，該菌是魚類、兩棲類、爬行類 的重要致病菌。由其引起的愛德華菌病是養殖魚類常見的傳染病，對養殖 動物的健康和水產養殖業危害巨大。在我國，已經從養殖的牛蛙、鱉、鰻 鱺、牙鲆、大菱鲆、真鯛等多種動物中分離到致病性的愛德華菌。

由于在生產過程中使用各種抗生素進行疾病的防治，已經在世界各地 分離到越來越多的愛德華菌抗藥性菌株，其中多數菌株呈多重抗藥性，不 僅使治療效果下降，而且多種抗藥性菌株和抗藥質粒的存在增加了環境的 壓力，對環境造成嚴重的威脅。早在1981年，國際上就成立了世界《慎用 抗生素聯盟》，其成員國已達到90多個國家。目前，不少國家已經明令禁 止在動物飼料中使用抗生素添加劑。我國加入WTO后，解決抗生素殘留等 問題已經刻不容緩。為了減少抗生素對環境的影響，通過免疫途徑防治愛 德華氏菌病發生無疑是一種最佳的方式。人們對遲鈍愛德華氏菌的各種疫 苗組成(包括滅活菌體細胞苗、脂多糖LPS、去類脂A的多糖、溶血素)和 免疫途徑(包括注射、浸泡、口服)進行了大量的工作，但這些滅活疫苗 或亞單位疫苗的保護效果都不理想，沒有達到疾病防控的要求。

遲緩愛德華菌的毒力因子有溶血素、軟骨素酶、皮下壞死毒素、過氧 化氫酶以及蛋白分泌系統，如三型(T3SS)和六型(T6SS)分泌系統，這 些致病因子參與了細菌的黏附、定殖、侵襲和在動物宿主體內的繁殖和擴 散過程。由于遲緩愛德華菌可侵入宿主的上皮細胞和吞噬細胞，并在細胞 內生長和繁殖，因此作為一種有效的疫苗，只有系統地刺激動物體液和細 胞的免疫應答反應才可能達到防治愛德華菌病的目的。由于滅活疫苗或亞 單位疫苗存在保護抗原不完全、免疫應答反應不全面，尤其是它們主要引 起動物的體液免疫應答而不能有效地刺激細胞免疫應答，是疾病防控效果 不理想的根本原因；其次是滅活疫苗和亞單位疫苗主要通過注射方式進行 魚類免疫，存在勞動力成本高、給藥不方便、容易引起動物應激等副作用。 因此到目前為止，還沒有可用的遲緩愛德華菌疫苗進入市場。

弱毒活疫苗對動物低毒活無毒，能夠有效地激發動物的體液和細胞免 疫應答，為動物提供全面的免疫保護，是目前疫苗開發領域的主要發展方 向之一；同時以弱毒活疫苗作為表達異源抗原的載體而進行多價疫苗的開 發是國際的前沿和熱點。目前，美國專利有利用利福平(rifampicin)培 養基對遲緩愛德華菌進行多次傳代的方法篩選弱毒株作為弱毒活疫苗 (United?States?Patent?7067122)，該方法得到的弱毒株遺傳背景不清 楚，細菌毒力減弱的機理不明確，在使用時容易造成毒力回復，同時難以 對疫苗株進行環境監控。利用轉座子或基因插入失活技術構建的弱毒疫苗 攜帶有抗生素和其他外源基因片斷，施用時容易將抗生素和外源基因片斷 釋放到環境，存在有基因轉移或整合到其他病原體或其他生物的潛在危險。 因此這些弱毒活疫苗難以通過各國的生物制品安全檢察管理機構的審批法 規，從而難以實現商品化。

無標記基因突變技術可以對目的基因進行缺失突變。通過對多個目的 基因的大片段缺失，大大降低了施用時由于毒力回復而帶來的環境傳播危 險。另外，弱毒株不帶任何外源的抗生素篩選標記和外源基因片段，遺傳 背景清晰、毒力減弱機理明確，易于區分疫苗株和野生型菌株，便于對疫 苗株進行環境監控，提高疫苗的安全性和可控性。同時，以無標記基因突 變弱毒突變株作為疫苗載體表達異源抗原制備多價疫苗具有防治多種傳染 病的潛力，因而是目前國際的研究前沿和熱點領域。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的遲緩愛德華菌弱毒活疫苗，以消除傳 統弱毒疫苗存在的對環境和動物潛在的安全風險，為防治養殖魚類愛德華 菌病提供一種安全、經濟的遲緩愛德華菌弱毒菌株及應用。

為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為：