[發明專利]一種外指引序列文庫構建方法

無效

• 申請號: 200910162323.X
• 申請日: 2009-08-12
• 公開（公告）號: CN101634048A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 鄭文嶺;嚴啟滔;劉媛媛;馬文麗
• 申請（專利權）人: 廣州金琪基因技術研究發展中心
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12P19/34;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京英特普羅知識產權代理有限公司
• 代理人: 齊永紅

技術領域

本發明涉及一種生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種外指引序列文庫構建方法，從而方便從文庫中篩選出可用作基因治療意義的外指引序列EGS。

背景技術

外指引序列(External?Guided?Sequence，以下均簡稱EGS)技術于80年代后期首先發現，其主要功能是體內定向滅活功能基因，EGS為小分子RNA功能分子，因而應該屬于廣義的RNA干擾技術(RNAi)。但與目前流行的RNAi技術不同的是，EGS采用更短的RNA分子(10mer)，即可特異作用于靶基因，從而導致靶基因定向滅活。目前針對EGS的國際專利已存在，但美國專利說明書US6057153、US6783981和US5877162等主要是針對單個EGS分子的設計。目前仍沒有實用的可用于高通量EGS的篩選的EGS文庫(簡稱LEGS)，而這種文庫的產生將有益于針對特殊疾病如愛滋病、肝炎及癌癥等的基因新藥開發。

發明內容

本發明的內容是EGS文庫的構建，更具體地，本發明公開了一種EGS文庫的構建方法：首先通過涉及EGS文庫的設計框架對其進行修飾得到EGS的理論文庫，然后將EGS理論文庫的表達框克隆至pET28a載體構建重組載體，后將重組載體轉化至感受態細胞以篩選陽性克隆。

附圖說明

圖1為EGS文庫設計圖，其中：

圖1-1：“3/4?EGS”設計框架來源于大腸桿菌酪氨酸轉運RNA的前體序列；

圖1-2：外指引序列文庫，外指引序列識別結構域由隨機堿基組成；為了避免“CCA”序列直接暴露給核酸酶，“UUU”序列連接在它的3′末端；

圖1-3：外指引序列文庫與潛在的靶標RNA形成的復合體，箭頭指示了核酸酶P的切割位點。

圖2為引物FLEGSp和RLEGSp示意圖；部分隨機化的寡聚核苷酸FLEGSp和RLEGSp由兩部分組成，一部分用于擴增pET28a-D載體(除了不包含T7啟動子和T7終止子之間的片段以外，可等同于pET28a載體)，另一部分用于擴增外指引序列文庫表達框；

圖3為EGS文庫構建示意圖，其中：

圖3-1：pET28a-LEGS構建的流程圖；

圖3-2：pET28a-LEGS的PCR產物鑒定圖，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶；

圖4為EGS文庫鑒定示意圖，其中：

圖4-1：pET28a-EGS克隆酶切鑒定模式圖，RV1泳道為含一個HincII酶切位點的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意圖，RV2泳道為含二或三個HincII酶切位點的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意圖，V泳道為pET28a被HincII酶切后的酶切示意圖，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶；

圖4-2：pET28a-EGS克隆酶切鑒定圖，1到42號泳道均為含一個HincII酶切位點的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切圖譜，V泳道為pET28a被HincII酶切后的酶切圖譜，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶；

圖4-3：pET28a-EGS克隆酶切鑒定圖，1號泳道均為為含兩個或三個HincII酶切位點的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切圖譜，V泳道為pET28a被HincII酶切后的酶切圖譜，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶；

圖4-4：部分EGS表達框序列的多重比較結果。

圖5為體外轉錄制備EGS示意圖，其中

圖5-1：EGS制備流程圖；

圖5-2：EGS的體外轉錄模板鑒定圖；

圖5-3：轉錄制備的EGS產物；

圖6為EGS文庫功能篩選意圖，其中：

圖6-1：體外篩選功能性EGS示意圖；

圖6-2：功能性EGS體內驗證示意圖；

圖7為EGS-c-myc功能鑒定示意圖，其中：

圖7-1：為EGS-c-myc結構示意圖；

圖7-2：為EGS-D-c-myc結構示意圖(EGS-c-myc的陰性對照)，園形標記標示了堿基突變；

圖7-3：為c-myc?mRNA被RNaseP體外切割所產生的產物的示意圖，泳道M為RNA?Marker，箭頭指示了大小為2-kb的RNA條帶，星號指示了大小為0.5-kb的RNA條帶，泳道1為c-myc?mRNA被RNaseP體外切割所產生的產物；

圖7-4為c-myc表達水平檢測結果，其中：

圖7-4-1為熒光實時定量PCR檢測結果，