[發明專利]一種外指引序列文庫構建方法

無效

• 申請號: 200910162323.X
• 申請日: 2009-08-12
• 公開（公告）號: CN101634048A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 鄭文嶺;嚴啟滔;劉媛媛;馬文麗
• 申請（專利權）人: 廣州金琪基因技術研究發展中心
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12P19/34;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京英特普羅知識產權代理有限公司
• 代理人: 齊永紅

1.一種外指引序列文庫構建方法，包括外指引序列文庫的設計和外指引序列文庫構建兩部分，其中引序列文庫的設計包括a.選擇圖1中的“3/4EGS”作為外指引序列文庫的設計框架；b.隨機堿基組成“3/4EGS”的靶標配對區域作為外指引序列文庫的理論文庫；c.在“3/4EGS”最3′端的CCA末端添加UUU。

2.權利要求1所述的外指引序列文庫構建方法，其特征在于外指引序列文庫構建包括以下步驟：

a.設計引物FLEGSp和FLEGSp并對它們的5′端進行磷酸化修飾，引物FLEGSp的序列為SEQ?ID?NO：1，RLEGSp的DNA序列為SEQ?ID?NO：2；

b.通過PCR擴增把EGS的理論文庫的表達框克隆至載體；

c.純化PCR產物并對純化的PCR產物進行分子內連接，后對連接產物進行后處理從而得到含有外指引序列文庫的重組載體。

3.權利要求2所述的外指引序列文庫構建方法，其中步驟b中載體為pET28a。

4.權利要求2所述的外指引序列文庫構建方法，其中步驟b中PCR擴增包括預變性、變形、退火、延伸再延伸五個步驟。

5.權利要求2所述的外指引序列文庫構建方法，其中步驟c中PCR產物進行分子內連接的反應條件為15℃，16小時。