[發(fā)明專利]從結(jié)締組織中獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910143281.5
• 申請日: 2009-05-22
• 公開（公告）號: CN101629164A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉洋;閆銘杰
• 申請（專利權(quán)）人: 協(xié)和華東干細(xì)胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;C12N5/06
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 連 圍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從結(jié)締組織中獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal?stromal?cells，MSC)是一種起源于中胚層，主要存在于骨髓中，具有多向分化潛能的一類干細(xì)胞，也有人從肌肉、骨、脂肪組織中獲得。MSC具有干細(xì)胞的共性，體積小，核漿大，不表達(dá)分化相關(guān)的標(biāo)志，也不表達(dá)造血干細(xì)胞的標(biāo)志。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，MSC可以定向誘導(dǎo)分化為成骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉及其它中胚層組織，這為MSC的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

利用MSC進(jìn)行組織工程學(xué)研究和應(yīng)用具有很多優(yōu)勢；由它誘導(dǎo)而來的組織在進(jìn)行移植時不存在組織配型及免疫排斥的問題。正因為MSC無論從來源、分離及可分化的組織類型上都有其獨特的優(yōu)勢，MSC的作用會越來越大。

目前，應(yīng)用較多較廣的主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，主要取自體骨髓。但是提取自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞需做骨髓穿刺，且隨供者年齡增長，MSC的數(shù)量和增殖能力顯著下降的缺點，這就不得不讓我們開始考慮尋找間充質(zhì)干細(xì)胞新的來源，以滿足未來科研工作和臨床應(yīng)用研究的需要。

當(dāng)前的研究表明：在人體內(nèi)，除骨髓外，臍帶華通氏膠、脂肪等結(jié)締組織中也含有間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，尤其是華通氏膠、脂肪等結(jié)締組織來源與骨髓來源相比具有取材方便，且多屬醫(yī)療廢棄物，不易給患者造成二次傷害等優(yōu)點。

專利號為200580012239.X公開了采用單純膠原酶消化和機(jī)械分離的方法獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。從實驗看，單純使用膠原酶消化(以華通氏膠為例)，細(xì)胞得率最高的一次也只能勉強(qiáng)能達(dá)到10⁶數(shù)量級(這個數(shù)量與臍帶組織所含有的有核細(xì)胞數(shù)有較大差距，往往間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞在有核細(xì)胞中又只占一小部分)，這與文獻(xiàn)報道每根臍帶約含有4000000個間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量相差巨大，這也充分說明此法分離效率低下。

同時，如果采用延長消化時間的方法，雖然可以部分提高細(xì)胞的產(chǎn)量，但也致使細(xì)胞活性降低，貼壁率大幅下降，不得不轉(zhuǎn)而采取高密度接種的方法補(bǔ)救，而消化過短，則又面臨細(xì)胞數(shù)較少的兩難困境，這就使我們后續(xù)實驗不得不采取大量擴(kuò)增細(xì)胞的方法，以彌補(bǔ)原代細(xì)胞數(shù)量上的不足。但這也會造成間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的原始特性隨著多次擴(kuò)增傳代而逐漸消失的不良后果。

造成消化后細(xì)胞得率低的主要原因在于，膠原酶消化后消化液出現(xiàn)膠狀物，這些膠狀物大量粘附細(xì)胞，在一些專利和文獻(xiàn)中使用15min1000xg的離心條件，也難以有效分離，而長時間高速離心也極大的傷害了細(xì)胞的活性。對于膠狀物，分析認(rèn)為由于低濃度的膠原酶打開了膠原的三維空間結(jié)構(gòu)卻沒有足夠的數(shù)量完全摧毀掉膠原蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)，致使膠原蛋白繼續(xù)纏繞細(xì)胞，但如果增大膠原酶的量不僅對于消化效率沒有顯著提高，還由于膠原酶的使用量過大而對細(xì)胞產(chǎn)生不良作用，致使貼比率下降；另一方面結(jié)締組織中大量含有彈性纖維和多糖等大分子長鏈結(jié)構(gòu)，這些物質(zhì)并不能為膠原酶所破壞，且極易溶于水，能通過細(xì)胞表面受體與細(xì)胞結(jié)合，纏繞細(xì)胞，懸浮于消化液中。同時上述物質(zhì)的存在也加大了溶液的粘度，降低了離心效率。

專利200510015492.2公開的技術(shù)則是在膠原消化后，再引入了胰酶進(jìn)一步消化，以期用胰酶消化打開結(jié)締組織中的彈性纖維結(jié)構(gòu)，將細(xì)胞從組織中釋放出來，但實際應(yīng)用中短時間使用胰酶，對提高提取效率并未顯著提高，且由于胰酶對細(xì)胞傷害作用明顯，超過10分鐘即會產(chǎn)生不可逆的傷害作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種從結(jié)締組織中獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案：

從結(jié)締組織中獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法，包括結(jié)締組織間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的分離方法，臍帶結(jié)締組織間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的分離方法及脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離提取方法。

上述技術(shù)方案中，所述的結(jié)締組織間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的分離方法，包括如下的技術(shù)步驟：

(1)取無菌獲得的結(jié)締組織，保存在分離液中，1-24h內(nèi)處理；

(2)清洗液反復(fù)沖洗組織，重懸洗去紅細(xì)胞，剪碎組織；

(3)轉(zhuǎn)移剪碎組織50ml離心管，加入清洗液，250g室溫離心5min，去除上清液；

(4)用清洗液再次重懸清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于氣浴振蕩器37℃，200r/min消化1h；