[發(fā)明專利]從結(jié)締組織中獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910143281.5
• 申請(qǐng)日: 2009-05-22
• 公開（公告）號(hào): CN101629164A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉洋;閆銘杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 協(xié)和華東干細(xì)胞基因工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/08
• 分類號(hào): C12N5/08;C12N5/06
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 連 圍

1.從結(jié)締組織中獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于包括結(jié)締組織間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的分離方法，臍帶結(jié)締組織間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的分離方法及脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離提取方法。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從結(jié)締組織中獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于：所述的結(jié)締組織間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的分離方法，包括如下的技術(shù)步驟：

(1)取無(wú)菌獲得的結(jié)締組織，保存在分離液中，1-24h內(nèi)處理；

(2)清洗液反復(fù)沖洗組織，重懸洗去紅細(xì)胞，剪碎組織；

(3)轉(zhuǎn)移剪碎組織50ml離心管，加入清洗液，250g室溫離心5min，去除上清液；

(4)用清洗液再次重懸清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于氣浴振蕩器37℃，200r/min消化1h；

(5)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭離心管表面，酒精燈火焰短暫灼燒離心管口后，將消化液移出，用300目無(wú)菌濾網(wǎng)和10cm直徑無(wú)菌漏斗過(guò)濾，收集濾液；

(6)收集濾液，加入20ml分離液混勻，300xg×5min離心；

(7)棄去上清，加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打混勻，制成2×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml混懸液；

(8)按2×10⁵/瓶接種培養(yǎng)瓶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從結(jié)締組織中獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于：臍帶結(jié)締組織間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的分離方法包括如下的技術(shù)步驟：

(1)用蘸有75％酒精的酒精棉球，搽拭臍帶采集瓶表面，用酒精燈快速灼燒瓶口后，打開采集瓶；

(2)用無(wú)菌止血鉗將臍帶輕輕鉗出，避免觸碰到別的物品，將它置于裝有80ml消毒液的無(wú)菌燒杯中浸泡3-5min，然后使用清洗液清洗臍帶2-5min，重復(fù)兩次；

(3)用止血鉗從清洗液中取出臍帶，放入腎型盤中，用止血鉗固定住一頭，使用手術(shù)剪截取15cm無(wú)凝血臍帶，并將之分割成多節(jié)5cm長(zhǎng)臍帶，將多節(jié)臍帶放入裝有80ml清洗液的無(wú)菌燒杯中沖洗掉血管中血污；

(4)用止血鉗取出一節(jié)置于腎型盤中，撕開臍帶外皮，若臍帶韌性太強(qiáng)可用剪刀剪開，表皮剝離盡量薄；

(5)盡量完整剝離靜脈；

(6)觀察動(dòng)脈位置后，依先難后易的原則，依次剝開兩根動(dòng)脈外結(jié)締組織，完整剝離動(dòng)脈；

(7)按以上步驟，依次剝離5節(jié)臍帶，將剝除血管及表皮的臍帶組織粉碎至5×5×5mm³；

(8)將組織碎塊，移入50ml離心管中，用清洗液重懸清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于氣浴振蕩器37℃，200r/min消化1h；

(9)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭離心管表面，酒精燈火焰短暫灼燒離心管口后，將消化液移出，用300目無(wú)菌濾網(wǎng)和10cm直徑無(wú)菌漏斗過(guò)濾，收集濾液；

(10)收集濾液，加入20ml分離液混勻，300xg×5min離心；

(11)棄去上清液，加入40ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，用5ml移液管吹打混勻，300xg×5min離心；

(12)棄去上清，加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打混勻，制成2×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml混懸液；

(13).按2×10⁵/瓶接種培養(yǎng)瓶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從結(jié)締組織中獲取間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于：脂肪干細(xì)胞的分離提取方法，包括如下技術(shù)步驟：

(1)取抽脂術(shù)中無(wú)菌獲得的脂肪，保存在分離液中，1-24h內(nèi)處理；

(2)清洗液反復(fù)沖洗脂肪，重懸洗去紅細(xì)胞，剪碎脂肪；

(3)轉(zhuǎn)移剪碎組織50ml離心管，加入清洗液，250g室溫離心5min，去除上清液；

(4)用清洗液再次重懸清洗后，加入18ml消化液和2ml催化液，置于氣浴振蕩器37℃，200r/min消化1h；

(5)用蘸有75％酒精的棉球，搽拭離心管表面，酒精燈火焰短暫灼燒離心管口后，將消化液移出，用300目無(wú)菌濾網(wǎng)和10cm直徑無(wú)菌漏斗過(guò)濾，收集濾液；

(6)收集濾液，加入20ml分離液混勻，300xg×5min離心；

(7)棄去上清，加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打混勻，制成2×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml混懸液；

(8)按2×10⁵/瓶接種培養(yǎng)瓶。