[發(fā)明專利]EV71病毒中和表位抗原檢測試劑盒或試劑及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910131382.0
• 申請日: 2009-04-16
• 公開（公告）號: CN101598733A
• 公開（公告）日: 2009-12-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡芳;高強(qiáng);張小梅;尹衛(wèi)東
• 申請（專利權(quán)）人: 北京科興生物制品有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 羅菊華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒抗原含量檢測試劑盒及其制備方法，具體涉及對EV71病毒抗原含量進(jìn)行定量的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法。?

背景技術(shù)

手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報道。1957年新西蘭首次報道該病，1958年分離出柯薩奇病毒，1959年提出手足口病名稱。手足口病的早期病原體主要為Cox?A16型，但1969年美國在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離出EV71病毒并被首次確認(rèn)。此后EV71感染與Cox?A16感染交替出現(xiàn)，成為手足口病的主要病原體。20世紀(jì)70年代中期，保加利亞、匈牙利相繼暴發(fā)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主要臨床特征的EV71性流行病，其中保加利亞于1975年報告病例750例(其中149人致癱，44人死亡)。1994年英國暴發(fā)了Cox?A16引起的手足口，病患者大多為1-4歲嬰幼兒。英國1963年以來的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，手足口病流行的間隔期為2-3年。20世紀(jì)90年代后期，EV71開始東南亞地區(qū)流行。1997年馬來西亞發(fā)生了主要由EV71引起的手足口病流行，4-8月共有2628人發(fā)病，4-6月有29例病人死亡。?

由于無疫苗、藥物等特異性的防控手段，該病存在隱性感染和輕癥病例多，傳染源難以發(fā)現(xiàn)和控制，兒童普遍易感，傳播途徑多，難以有效阻斷等原因，預(yù)防控制EV71帶來的手足口病難度較大。由于EV71引起的手足口病影響范圍的廣泛性、危害的嚴(yán)重性，該病在我國已納入丙類傳染病管理。鑒于此，國內(nèi)外學(xué)者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。?

疫苗的有效性在于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，與病毒結(jié)構(gòu)蛋白上的?中和抗原表位結(jié)合，阻斷該表位與敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，從而阻止該病毒入侵敏感細(xì)胞，發(fā)揮疫苗的保護(hù)作用。EV71病毒顆粒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突出，直徑約24～30nm，其基因組為單股正鏈RNA。EV71型病毒基因組編碼的分子量分別為35KD、28KD、24KD和7KD的多肽VP1(α)、VP2(β)、VP?3(γ)、VP4(δ)。這些多肽構(gòu)成原聚體，繼而再拼裝成具有五聚體樣結(jié)構(gòu)的亞單位(pentameric?unit)。60個亞單位通過各自的結(jié)構(gòu)域相互連接，最終形成病毒的外殼。?

VP1、VP2和VP3三個多肽暴露在病毒外殼的表面，而VP4包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接。在這些蛋白中，VP1被認(rèn)為是負(fù)責(zé)病毒與靶細(xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì)，因此它具有中和病毒主要的抗原決定簇，直接決定病毒的抗原性。A、B、C三基因型EV71病毒的VP1同源性較高，大于94％。資料顯示，VP1是一個高度保守的區(qū)域，是EV71病毒有效的中和決定簇與合適的靶抗原。VP1起始于2438bp-3328bp(BrCr)，由891個核苷酸組成。1999年，Brown等根據(jù)1970～1998年分離于美國和其它5個國家的113株EV71的VP1全基因序列，將EV71分為A、B、C三個基因型。核苷酸序列型間差異為16.5％～19.7％。?

同時，研究表明腸道病毒存在著眾多的型內(nèi)、型間的交叉反應(yīng)性，并且存在著較高的重組性。其中EV71與Cox?A16的相似性達(dá)到了80％，擁有很多共同表位，許多克隆抗體EV71的單抗具有了與Cox?A16的交叉反應(yīng)性。成為EV71抗原檢測方法建立的一項制約。?

常規(guī)的針對EV71病毒的診斷方法主要通過分離病毒，中和抗體檢測和免疫組織化學(xué)法來進(jìn)行。但這些方法費時、費力，無法滿足疾病流行期間同時大量處理大量標(biāo)本的需要。同時，鑒于EV71病毒的危害性，有必要開發(fā)一種簡單快速易行的檢測EV71病毒抗原表位含量的檢測方法。該研究使用的抗EV71單克隆抗體具有高效的EV71病毒A、B、C三基因型的中和效果，同時與Cox?A16無交叉反應(yīng)性，有效避免了抗原檢測中與EV7180％相似性的Cox?A16的假陽性干擾。因此，所述方法?的成功開發(fā)對于疫苗的研發(fā)中抗原表位這一有效組分的檢測有著重要的意義，同時該方法也為EV71疾病的防治、早期篩查、診斷工作提供了準(zhǔn)確、簡便、有效的監(jiān)測手段，具有廣泛的應(yīng)用范圍和社會需求。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對疫苗研發(fā)過程中樣品有效抗原表位的監(jiān)控，出于縮短檢測周期、節(jié)約成本以及盡可能地減少實驗動物使用的人道主義精神出發(fā)，提供一種EV71病毒中和表位抗原定量酶聯(lián)免疫診斷試劑盒或試劑、其制備方法及其使用方法。?

具體的，本發(fā)明一方面提供了一種檢測EV71抗原含量的試劑盒或試劑，其包含保藏號為CGMCC?No.2937的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段。?