[發明專利]一種山羊支原體山羊肺炎亞種抗原及其制備方法

有效

• 申請號: 200910117576.5
• 申請日: 2009-11-07
• 公開（公告）號: CN101712971A
• 公開（公告）日: 2010-05-26
• 發明（設計）人: 逯忠新;儲岳峰;趙萍;高鵬程;賀英;郭晗
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;G01N33/531;G01N33/86;G01N33/569
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 鮮林

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，具體說是一種用于檢測山羊支原體山羊肺炎亞種抗體的間接血凝診斷試劑。?

背景技術

山羊支原體山羊肺炎亞種是山羊傳染性胸膜肺炎的病原，山羊傳染性胸膜肺炎是世界動物衛生組織(OIE)所列需要上報和監控的重要疾病之一，主要流行于非洲、亞洲和地中海沿岸各養羊國家和地區，每年給這些地區的養羊業帶來嚴重經濟損失。本病在我國發生的最早文字記載可追溯到1922年的新疆伊犁地區，此后甘肅、寧夏、青海、四川、貴州、廣西、河北、遼寧、內蒙、江蘇、湖南、河南等十余省市均有臨床診斷報道，危害嚴重。但遺憾的是，迄今這些報道大多為根據臨床表現和剖檢變化做出的臨診報告，鮮見應用準確的實驗室診斷技術。因此，本病在我國的實際流行情況和準確的流行病學信息仍較為匱乏，造成這種現象的原因，主要是我國目前缺乏有效的檢測山羊支原體山羊肺炎亞種的相關技術。?

發明內容

本發明的目的是為了解決當前我國缺乏山羊支原體山羊肺炎亞種抗體檢測技術難題，提供一種采用山羊支原體山羊肺炎亞種多糖抗原致敏醛化-鞣酸化綿羊紅細胞制備的間接血凝診斷試劑。?

本發明的目的通過下述技術方案實現：?

一種制備山羊支原體山羊肺炎亞種多糖抗原的方法，從山羊支原體山羊肺炎亞種培養物上清中提取菌體分泌多糖，采用以下步驟制備：?

a支原體培養?

將山羊支原體山羊肺炎亞種接種支原體培養基，37℃培養，當培養基顏色變為黃色時，pH值下降至6.8～7.0，按1∶20的體積比連續擴大培養3次，取培養物12000rpm離心30min，收獲上清備用；?

b支原體多糖抗原的提取?

b.1用冰醋酸調節培養物上清pH值到5.0，煮沸60min，等冷卻后用?濾紙過濾，去除雜質，得到濾液；?

b.2將無水乙醇按2∶1的體積比加入到上一部所得濾液中混勻，置于4℃條件下過夜后，5000rpm離心20min，去上清，將沉淀物溶解于滅菌水中；加入等體積的60％苯酚，混勻，68℃水浴1h，取出置4℃條件下過夜后，6000rpm離心30min，將上清裝入透析袋中，用自來水透析48h；?

b.3將無水乙醇按2∶1的體積比加入到透析液中混勻，置4℃條件下過夜后，7000rpm離心30min，棄上清，收集沉淀物；將沉淀物溶于滅菌水，裝入透析袋中，用雙蒸水透析48h，每4h換一次水；?

b.4取出透析袋，用電吹風或37℃溫箱中通過蒸發將透析液進行10～20倍濃縮，濃縮液即為多糖抗原；用苯酚-濃硫酸法測定多糖的含量。?

一種用于檢測山羊支原體山羊肺炎亞種抗體的間接血凝診斷試劑，采用上述制備的山羊支原體山羊肺炎亞種多糖抗原致敏醛化-鞣酸化綿羊紅細胞，所述抗原的最佳致敏濃度為10μg/ml～20μg/ml，按下述步驟制備：?

取1份多糖抗原與1份10％醛化-鞣酸化綿羊紅細胞混合均勻，在37℃水浴中作用50min，其間不斷攪拌；離心沉積紅細胞，用含1％健康兔血清的0.15mol/L?pH7.2PBS洗滌三次后，配成1％致敏紅細胞懸液，即為間接血凝診斷抗原，與配套試劑組裝成檢測山羊支原體山羊肺炎亞種抗體的間接血凝診斷試劑，包括：抗原1瓶，10ml/瓶；標準陽性血清1瓶，1ml/瓶；標準陰性血清1瓶，1ml/瓶；稀釋液3瓶，10ml/瓶。?

檢測時，先在96孔“∨”型聚苯乙烯滴定板(8行12列)上每孔滴加稀釋液25μL；然后在1～9列每列第1孔分別加入被檢血清25μL(每份被檢血清用1列)，第10、11列第1孔分別加入標準陽性血清、標準陰性血清各25μL，第12列為空白對照。用排槍將1～11列第1孔充分混勻后吸取25μL加入第2孔，依次連續稀釋至第8孔，混勻后從第8孔棄去25μL；最后每孔滴加1％致敏紅細胞懸液(診斷抗原)25μL，加樣完畢將∨型滴定板放在微量震蕩器上震蕩1min，置37℃溫箱2h，判定結果。?

判定標準：紅細胞全部凝集(++++)；75％紅細胞凝集(+++)；50％紅細胞凝集(++)；25％紅細胞凝集(+)；無凝集(-)。陽性血清對照1～8孔應呈現“++++～++”凝集；陰性血清和空白對照應呈現“-”。在對照孔合?格的前提下，觀察待檢血清各孔。以呈現“++”凝集的最大稀釋倍數作為該份血清的抗體效價。效價≥1∶8(++)判為陽性，效價≤1∶4(++)判為陰性。效價介于兩者之間判為可疑，需重新測定，仍為可疑判為陽性。?