[發明專利]磁性納米固定化酶催化生產大豆異黃酮苷元的方法

無效

• 申請號: 200910116404.6
• 申請日: 2009-03-25
• 公開（公告）號: CN101532039A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 羅建平;潘利華;查學強;王貴娟;徐學玲
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12N11/14
• 代理公司: 合肥金安專利事務所
• 代理人: 金惠貞

1、磁性納米固定化酶催化生產大豆異黃酮苷元的方法，其特征在于包括以下操作步驟：

(1)、糖苷型大豆異黃酮原料的超臨界流體萃取富集：

取用夾帶劑充分潤濕的糖苷型大豆異黃酮原料，在夾帶劑、萃取壓力20-40Mpa、萃取溫度30-50℃的條件下超臨界二氧化碳流體萃取2-4h后，從分離釜中放出萃取物；去除萃取物中的夾帶劑，獲得糖苷型大豆異黃酮原料；

(2)、大豆異黃酮糖苷水解酶的提取：

在由麥麩2.0g/L，硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸亞鐵0.01g/L組成的培養基上接種黑曲霉，接種量15％，裝液量70mL/100mL三角瓶；在搖瓶轉速200±5r/min、溫度為30±0.5℃條件下發酵3天；將發酵液于10000r/min，4℃條件下離心10min，取上清液為β-葡萄糖苷酶粗酶液；用30％～80％飽和度的硫酸銨沉淀β-葡萄糖苷酶粗酶液；將沉淀物溶于0.1mol/L、pH5.0的乙酸緩沖液于溫度4℃下離心脫鹽、濃縮；濃縮液上離子交換樹脂DEAE-52樹脂分離柱，用0.2mol/L、pH6.8的磷酸緩沖液洗脫樹脂分離柱，收集β-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液A，收集液A經截留分子量為500-1000道爾頓的超濾膜系統離心濃縮后，進行葡聚糖凝膠柱層析，收集β-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液B；收集液B經截留分子量為500-1000道爾頓的超濾膜系統離心濃縮，獲得β-葡萄糖苷酶溶液；用0.1mol/L、pH5.0的乙酸緩沖液調節β-葡萄糖苷酶溶液，得到酶活力為1500-2000U/mL的大豆異黃酮糖苷水解酶溶液即黑曲霉β-葡萄糖苷酶溶液；

(3)、磁性納米固定化酶的制備：

取0.5-1.0g磁性納米粒子加到4.5ml的pH4.0-6.0醋酸緩沖液中，然后加入體積分數為2％v/v戊二醛溶液0.5ml，中低頻超聲分散；再按照0.5-10mL/0.5-1.0g磁性納米粒子的比例加入黑曲霉β-葡萄糖苷酶溶液，放置水浴恒溫震蕩器中，溫度20-30℃、轉速100-150r/min條件下固定化2-4h，利用永久磁鐵收集固定化酶粒子；固定化酶粒子用pH4.0-6.0醋酸緩沖液清洗，直至流出液無蛋白檢出，獲得磁性納米固定化酶；

(4)、糖苷型大豆異黃酮原料的磁性納米固定化酶催化轉化：

將糖苷型大豆異黃酮原料用pH4.5醋酸緩沖液配制成0.5-1.0mg/mL的溶液，并用1.0mol//L的鹽酸調節所述溶液的pH至4.9-5.1，得到大豆異黃酮糖苷溶液；將上述步驟3)中所得的磁性納米固定化酶按照0.8-1.2g/0.8-1.2mL的比例加入pH5.0醋酸緩沖液中，充分攪拌使其懸浮均勻，形成磁性納米固定化酶懸浮液；向所述大豆異黃酮糖苷溶液中加入磁性納米固定化酶懸浮液形成混合液，加入的磁性納米固定化酶懸浮液體積為所述大豆異黃酮糖苷溶液體積的0.5～1倍；將所述混合液在溫度20-50℃條件反應20min-60min，獲得高大豆異黃酮苷元含量的轉化液；

(5)、大豆異黃酮苷元的提取：

離心或外加磁場分離高大豆異黃酮苷元含量的轉化液中的磁性納米固定化酶，獲得大豆異黃酮苷元溶液；大豆異黃酮苷元溶液減壓濃縮得到高純度大豆異黃酮苷元成品。

2、根據權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產大豆異黃酮苷元的方法，其特征在于：所述糖苷型大豆異黃酮原料為脫脂大豆粉或大豆胚芽粉或脫脂豆粕。

3、根據權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產大豆異黃酮苷元的方法，其特征在于：所述步驟(1)的超臨界流體萃取過程所用的夾帶劑為甲醇或乙醇或乙酸乙酯或甲醇與水的混合溶劑或乙醇與水混合溶劑，加入量為投入原料量的100-300％。

4、根據權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產大豆異黃酮苷元的方法，其特征在于：所述磁性納米粒子為氮化鋁或四氧化三鐵或氧化鈦，其平均粒徑15-100nm。

5、根據權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產大豆異黃酮苷元的方法，其特征在于：所述步驟(5)的離心條件為5000-10000r/min、2-8℃離心15-20min。

6、根據權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產大豆異黃酮苷元的方法，其特征在于：所述外加磁場分離的具體操作方法是，將永久磁鐵條放入上述步驟(4)取得的轉化液中攪拌1-2分鐘，磁性納米固定化酶被吸附在永久磁鐵條上。

7、根據權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產大豆異黃酮苷元的方法，其特征在于：所述大豆異黃酮糖苷水解酶的提取：

取發芽、芽長1-1.5cm的鷹嘴豆，加液氮研磨成勻漿狀，并在0.1Mol/L、pH5.0醋酸沖液中均質24h，在溫度4℃、12000r/min條件下離心10min，取上清液；向上清液緩慢加入30％-80％飽和度硫酸銨進行分級；取沉淀溶于0.1Mol/L醋酸緩沖液中，4℃冰箱透析18-24小時即得粗酶液；在溫度4℃條件，粗酶液離心脫鹽、濃縮；濃縮液上離子交換樹脂樹脂分離柱，用0.2mol/L、pH6.8的磷酸緩沖液洗脫樹脂分離柱，收集β-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液C，收集液C經截留分子量為500-1000道爾頓的超濾膜系統離心濃縮后，進行Sephadex?G-100柱層析，收集β-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液D；收集液D經截留分子量為500-1000道爾頓的超濾膜系統離心濃縮，濃縮液即為鷹嘴豆β-葡萄糖苷酶溶液。