[發明專利]一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產酸率的方法

無效

• 申請號: 200910112929.2
• 申請日: 2009-12-08
• 公開（公告）號: CN101717769A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發明（設計）人: 施巧琴;吳偉斌;黃祥峰;蔡愛金;左祖楨;翁雪清;鄭斌;黃欽耿;趙燕玉;葉玲敏;劉建明;吳松剛
• 申請（專利權）人: 福建省麥丹生物集團有限公司
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12P13/22
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 翁素華

【技術領域】

本發明涉及氨基酸制備技術領域，尤其涉及一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產酸率的方法。

【背景技術】

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是人體和動物生命活動中必須的八大氨基酸之一，對人體和動物的生長發育、新陳代謝起著重要的作用，廣泛應用于醫藥、食品、飼料和營養保健等領域。近年來，隨著對L-苯丙氨酸生理功能了解和科學研究的不斷深入，L-苯丙氨酸的應用越來越廣泛，已成為一種國際市場上發展前景好，市場需求大的產品。

國內外L-苯丙氨酸的生產方法主要有水解抽提法、化學合成法、酶法和發酵法這4種。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量較低，水解抽提法很少使用；化學合成法的工藝復雜，成本較高，在國外基本上被酶法和發酵法取代。但由于底物和酶的價格較高且來源有限，酶法應用也受到限制；微生物直接發酵法可利用廉價且易得的原料又可在常溫常壓下進行，是目前生產L-苯丙氨酸的主流方法，具有較大的競爭優勢。但是由于野生菌株體內L-苯丙氨酸等終產物對芳香氨基酸合成代謝途徑上的關鍵酶有著強烈的反饋抑制作用，使其細胞不能大量蓄積苯丙氨酸，因此若要進行實際發酵生產，就必須改造野生菌株，解除其代謝調控，使得代謝終產物能過量蓄積。

80年代中期，隨著載體和受體系統的構建及基因重組等基因工程技術的發展，用基因工程的方法通過對L-苯丙氨酸代謝途徑進行調控來構建L-苯丙氨酸生產菌株的研究在國外開展廣泛，并取得不少成績，而國內起步較晚。

基本原則為：選擇不再受到反饋抑制的關鍵酶突變子，并破壞苯丙氨酸的酶系。主要的方法有：通過選育結構抗類似物突變株以解除自身的反饋抑制；切斷由分支酸到預苯酸、VK、CoQ等的支路代謝；通過減少支路代謝，解除Trp和Tyr對DS的反饋調節，增加分支酸濃度的方法增加前體物；增加苯丙氨酸代謝流上aroF、pheA等關鍵酶基因的表達量以及切斷苯丙氨酸進一步代謝途徑等。

1985年，Ozaki等把一株抗苯丙氨酸結構類似物的生產菌株棒狀桿菌K38染色體上的CM和PD基因克隆到質粒pcE53中，再將重組質粒轉回親株，苯丙氨酸的產量達到19g/L，比親株提高50％；1987年Robinson等從E.coliB菌株克隆了高效的轉氨基基因，將重組質粒轉回親株，其芳香族氨基酸轉移酶活性為親株的10倍；1992年，Ikeda等從苯丙氨酸生產菌株中克隆了脫敏的DS、CM及PD酶基因，并將其串聯起來，克隆到同一個多拷貝的載體上，轉移到苯丙氨酸生產菌株中，使之代謝流向產苯丙氨酸方向轉移，產酸達28g/L.

1986年陳琦等采用原生質體融合的技術選育苯丙氨酸產生菌，以北京棒桿菌AS1.299為出發菌株，經過突變篩選，得到具有不同抗性的兩個親株，進行原生質體融合后，苯丙氨酸產量為0.6％，高于親株50％。但這種細胞內基因重組技術的缺點：是只有同種或近緣關系的微生物之間才能進行且成功率低。

1994年中國醫科大學生物技術中心的史燕東等將tyrB基因克隆質粒導入不同的宿主菌，得到產酸量提高的菌株；1999年復旦大學范長勝等通過將關鍵酶基因aroG、pheA進行串聯表達來構建苯丙氨酸生產菌株，較大幅度提高了工程菌苯丙氨酸的發酵產酸量，但是都未能達到工業化生產水平。

從以上國內外對L-苯丙氨酸基因工程菌育種情況看出，國內外從分子水平對L-苯丙氨酸菌株育種大部分停留在構建基因工程菌的水平，且產酸水平不夠理想，尚未看到在構建基因工程菌的基礎上進一步對構建的表達載體采用定向改造技術進行菌種改良。

高產L-苯丙氨酸基因工程菌的構建，除改變代謝流外還可通過關鍵酶基因的克隆表達增加酶的表達量和提高菌株對產物的反饋抑制雙重手段來提高產酸率。

此外，構建的重組表達載體質粒是否具有遺傳穩定性也是限制苯丙氨酸基因工程菌產酸的重要因素。重組質粒的不穩定性主要是指重組菌在培養過程中發生突變或者缺失，使重組菌失去原有的表型特征。如果細胞含有的質粒拷貝數過高，或帶有對宿主細胞有毒副作用的基因，以及以高密度培養或者連續培養的方式培養工程菌時，質粒的丟失率會大大增加等。

質粒載體含有的啟動子類型、par功能區、分離機制、復制起始點和啟動子的距離、啟動子的強度等序列信息都會影響質粒的穩定性。