[發(fā)明專利]一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910112929.2
• 申請日: 2009-12-08
• 公開（公告）號: CN101717769A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發(fā)明（設計）人: 施巧琴;吳偉斌;黃祥峰;蔡愛金;左祖楨;翁雪清;鄭斌;黃欽耿;趙燕玉;葉玲敏;劉建明;吳松剛
• 申請（專利權）人: 福建省麥丹生物集團有限公司
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12P13/22
• 代理公司: 福州市鼓樓區(qū)京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 翁素華

1.一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，其特征在于：將構建的L-苯丙氨酸基因工程菌的重組表達質粒作為一個整體進行定向突變；采用烷基化試劑EMS對表達質粒進行突變的過程中，通過EMS與質粒反應時間的長短來控制突變率以獲得在相同突變條件下的最佳突變時間，然后將經(jīng)EMS突變處理最佳突變時間后的表達質粒電轉化宿主菌構建菌株突變庫；最后進行穩(wěn)定高產(chǎn)突變菌株的篩選。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，其特征在于具體包括以下幾個步驟：

一、構建L-苯丙氨酸基因工程菌突變庫

(1)EMS體外改造重組表達載體致死率的選擇：以L-苯丙氨酸基因工程菌的表達質粒pbv-aroG-pheA作為突變對象，用烷基化試劑EMS對質粒DNA進行直接突變，取四支1.5ml?EP管，分別加入1.5μg純化表達質粒，分別溶于400μl高純水，加入4μl?EMS混勻后，于36℃溫浴0min、30min、60min、75min、90min，對突變條件進行選擇，確定最佳突變時間為60min；

(2)突變重組表達質粒電轉化宿主菌構建菌株突變庫：將經(jīng)EMS突變處理60min后的表達質粒電轉化酪氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主菌構建突變菌株庫；

二、從突變庫中篩選獲取高產(chǎn)穩(wěn)定的L-苯丙氨酸基因工程菌株

(1)抗高濃度對氟苯丙氨酸突變菌株的初步篩選：將電轉復蘇的菌液，按照4％的接種量分別接到含3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml對氟苯丙氨酸的LB/Amp培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)；

(2)高產(chǎn)穩(wěn)定突變菌株的高通量篩選：復蘇的突變菌株在對氟苯丙氨酸濃度為3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml的LB/Amp培養(yǎng)基中生長，含8mg/ml對氟苯丙氨酸的LB/Amp培養(yǎng)基菌未生長，而未突變質粒的基因工程菌H9-26在對氟苯丙氨酸濃度為4mg/ml的培養(yǎng)基就未見生長了，將7mg/ml對氟苯丙氨酸LB/Amp培養(yǎng)基中的突變菌株分離成單菌落，分別挑取突變菌株至含150μl?LB/Amp培養(yǎng)基的96孔板中于37℃、150rpm條件下培養(yǎng)48h，取突變菌株發(fā)酵上清液用鹽酸稀釋后，采用三波段測量法測定上清液中L-苯丙氨酸的濃度，從近萬株突變株中篩選獲得4株L-苯丙氨酸產(chǎn)量不同程度提高的優(yōu)良突變菌株；

(3)優(yōu)良突變株質粒穩(wěn)定性實驗：將從平板中挑取獲得的4株優(yōu)良突變菌株單菌落接入2ml?LB/Amp培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜，將種子20μl接入LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)使菌株在LB培養(yǎng)基中連續(xù)生長48h，繁殖70代以上，取樣涂于LB平板上，次日，隨機挑取菌落100個點在LB/Amp平板上，在平板上生長菌落的百分數(shù)均超過未改造L-苯丙氨酸基因工程菌質粒穩(wěn)定性的百分數(shù)。