[發明專利]一種擴增低含量基因突變DNA的引物設計方法及其應用

有效

• 申請號: 200910111500.1
• 申請日: 2009-04-13
• 公開（公告）號: CN101613698A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 阮力;何東華;鄭立謀
• 申請（專利權）人: 廈門艾德生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發明涉及一種新的核酸擴增引物設計方法，尤其涉及一種基于高野生型DNA背景下，擴增低含量基因突變DNA的引物設計方法，及其在核酸檢測上的應用。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)是基因擴增技術的一次重大飛躍，該技術1985年由美國PE公司遺傳部的Kary?B?Mullis教授發明。PCR技術首先應用于人β-珠蛋白DNA擴增及鐮刀狀紅細胞貧血癥的產前診斷。由于此項技術可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測到單分子或在10萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品。因而，此技術在短短的幾年內就廣泛的應用于分子生物學、醫學、微生物學、遺傳學等領域。

PCR技術實際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶(如Taq酶等)的酶促合成反應。PCR技術的特異性取決于引物和模板DNA結合的特異性。反應分三步：①變性(denaturation)：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。②退火(annealling)：當溫度突然降低時由于模板分子結構較引物要復雜的多，而且反應體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補復性的機會較少。③延伸(extension)：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷之磷酸底物及Mg2+存在的條件下，聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。以上3步為一個循環，每一個循環的產物可以作為下一個循環的模板，數小時之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復制。決定PCR擴增特異性的引物是由人工合成的一段寡核苷酸。在反應最初階段，原來的DNA起著起始模板的作用，隨著循環次數的遞增，由引物介導延伸的片段急劇地增多而成為主要模板。因此，絕大多數擴增產物將受到所加引物5′末端的限制，最終擴增產物是介于兩種引物5′端之間的DNA片段。

隨著生命科學研究的不斷進展，人們已經認識到核酸是決定遺傳信息的關鍵物質，通過檢測樣品中是否存在某種(些)核酸及其序列變異，就可以判斷出檢測對象是否攜帶某種病原微生物及其抗藥性、患有某種疾病或處于某種遺傳狀態等。因此，核酸分析技術已經廣泛應用于生命科學研究的眾多領域，包括病原微生物的鑒定、分型和耐藥性檢測；疾病診斷與預后等。

現有PCR技術設計的引物缺陷主要有：1)特異性不好，針對基因突變的普通方法設計的引物，常常產生非特異性擴增條帶。2)選擇性不好，在較高的野生型模板的背景下，針對較低含量的基因突變DNA的檢測能力有限，而往往大部分引起腫瘤的突變都是體細胞突變，突變細胞都是摻雜在野生型細胞內的，因此所提的DNA也是帶有大量野生型DNA的。

發明內容

本發明的目的在于針對在較高野生型模板的背景下，為有效擴增目的片段產物，提供一種簡單、廉價、高效的高特異的擴增目的產物的PCR擴增引物設計方法及其應用。

本發明的技術方案如下：首先按常規方法設計一對靶序列特異性引物，然后在每對所述引物對中的一條引物的5′末端加一段與待擴增靶序列無關的GC寡核苷酸尾，離3′末端的第5~8個寡核苷酸處插入3個A堿基片段，突變位置放在3′末端1-4位。

本發明所設計的引物結構，見附圖1(a)，所設計的引物對中的一條引物包括四個區域，從5′端到3′端分別為GC區、5′端配對區、3A區和3′端突變配對區；所設計的引物總長度不大于40bp。

為了使所設計的引物具有合適的TM值，所述寡核苷酸尾長度優選為2-5bp，Tm值在6-10℃，堿基數量優選為3bp。該GC區根據待擴增靶序列的特點來選擇，確保該區域與待擴增靶序列不會配對，且3個寡核苷酸可以是GGG或CCC，也可以是GC混合的堿基，但是所添加的無關堿基不與引物其他地方形成明顯的二級結構。

引物5′端配對區堿基數在16-26個堿基，Tm值在50-55℃左右，在引物退火時起到保證引物與靶序列有一定的結合效率的作用。