[發明專利]多重熒光 P C R同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物、探針、試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910111460.0
• 申請日: 2009-04-07
• 公開（公告）號: CN101603098A
• 公開（公告）日: 2009-12-16
• 發明（設計）人: 陳信忠;龔艷清;周昱;任聰;徐淑菲;孔繁德
• 申請（專利權）人: 廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64;C12R1/93
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司
• 代理人: 李 寧

1、一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物，其特征在于：由檢測對蝦白斑綜合征病毒的正向引物FP1和反向引物RP1以及檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的正向引物FP2和反向引物RP2組成；其中檢測對蝦白斑綜合征病毒的引物的正向引物FP1的序列SEQ?ID?NO.1和反向引物RP1的序列SEQ?ID?NO.2如下：

SEQ?ID?NO.1：5′-TGGAATGTCATCGCCAGCAC-3′；

SEQ?ID?NO.2：5′-CAGTTCAGATTCGTTACCGTTTCC-3′；

檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物的正向引物FP2的序列SEQ?ID?NO.4和反向引物RP2的序列SEQ?ID?NO.5如下：

SEQ?ID?NO.4：5’-GACATAGAGCTACAATCCTCGCCTAT-3’；

SEQ?ID?NO.5：5’-CAAGTACCGTAGTCGCTTCAGCTT-3’。

2、一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的探針，其特征在于：由檢測對蝦白斑綜合征病毒的探針LP1和檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的探針LP2組成；其中檢測對蝦白斑綜合征病毒的引物配合使用的探針LP1的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO.3：5′-CACCGCCGACGCCAAGGGAACTG-3′；

檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物配合使用的探針LP2的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO.6：5′-TGGGAGTTACCTTTGCTGCCAGAGCC-3′。

3、一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括權利要求1所述的檢測對蝦白斑綜合征病毒的正向引物FP1和反向引物RP1，檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的正向引物FP2和反向引物RP2；以及權利要求2所述的檢測對蝦白斑綜合征病毒的探針LP1和檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的探針LP2。

4、一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)根據權利要求1和權利要求2的引物、探針的核苷酸序列信息合成引物FP1、FP2、RP1、RP2和探針LP1、LP2的試劑盒，其中探針一端標記有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料；上述探針和引物分別配制成濃度為20μmol/L的溶液備用；

(2)采集健康和表現臨床病狀的活對蝦制備總DNA溶液，并從中分別提取健康活對蝦的總DNA模板和病癥對蝦的總DNA模板備用；

(3)然后以總DNA為模板，利用核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1的引物FP1、核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2的引物RP1、核苷酸序列為SEQID?NO.4的引物FP2、核苷酸序列為SEQ?ID?NO.6的引物RP2以及核苷酸序列為SEQ?ID?NO.3的探針LP1和核苷酸序列為SEQ?ID?NO.3的探針LP2進行實時熒光PCR檢測，每個循環結束采集數據并繪制熒光強度變化曲線，反應結束后根據曲線來分析判定對蝦白斑綜合征病毒和對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的存在。

5、如權利要求4所述的多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法，其特征在于：所述的探針一端標記有報告熒光染料是指探針LP1的5’端和探針LP2的5’標記有報告熒光染料，所述的另一端標記有淬滅熒光染料是指LP1的3’端和LP2的3’端標記有淬滅熒光染料。

6、如權利要求5所述的多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法，其特征在于：所述的報告熒光染料采用FAM熒光染料或HEX熒光染料；淬滅熒光染料采用Eclipse熒光染料；其中探針LP1的5’端標記有FAM熒光染料，LP2的5’標記有HEX熒光染料；LP1的3’端和LP2的3’端都標記有Eclipse熒光染料。