[發明專利]大豆檢疫性真菌病害多重實時熒光PCR檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 200910106615.1
• 申請日: 2009-04-10
• 公開（公告）號: CN101857905A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發明（設計）人: 章桂明;陳枝楠;程穎慧;王穎
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 羅瑤

技術領域

本發明涉及一種同時檢測大豆疫病菌、大豆擬莖點霉種子腐爛病菌、大豆南方莖潰瘍病菌、大豆北方莖潰瘍病菌四種中一種或多種大豆真菌病害的簡單、快速、特異、靈敏的實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒。適合于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。

背景技術

大豆(Glycine?max)是我國重要的油料作物和糧食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要來源，在我國國民經濟中占有重要地位。目前我國大豆產量居世界第四位，但仍然不能滿足國內植物油及飼料蛋白加工的需要。隨著我國進口大豆的數量逐年遞增，各種危害大豆生產的病害傳入的風險也逐漸增大。其中本發明涉及的四種大豆真菌病害是目前嚴重影響大豆生產及貿易的真菌病害，具有重要的檢疫重要性和經濟重要性。

大豆疫病菌(Phytophthora?sojae?Kaufmann&Gerdemann，簡稱PS)是大豆生產上的毀滅性病害之一，主要引起大豆疫霉根腐病(SoybeanPhytophthora?Root?Rot)。該病害在加拿大、阿根廷、巴西、澳大利亞、日本、中國等20多個國家均有發病報道，造成嚴重的經濟損失。1989-1991年間在美國大豆主產區的28個州，由該病害造成的年平均損失就達1.88億美元。目前全世界每年因大豆疫霉根腐病造成的損失達10多億美元。大豆疫霉菌在大豆的各個生長發育期均可侵染和危害，引起寄主根、莖、枝和種子腐爛，嚴重時造成絕產，是危害極其嚴重的土傳病害。由于疫霉菌的形態特征和生物學特性具有較大的變異，采用傳統的方法，難以區分形態和習性相似的種，而傳統的檢測方法檢測時間長、工作量大，無法滿足快速檢疫的需要。近年來國內外對該病的快速檢測方法主要集中在常規PCR和實時熒光PCR方法。

大豆擬莖點霉種子腐爛病菌(Phomopsis?longicolla，簡稱PL)造成種子皺縮、變長、皮裂，并出現白堊。感病的種子經常不能萌發或者萌發延遲。種子感病導致出苗前后的猝死，在惡劣條件下，嚴重影響大豆的產量和品質。感病的作物殘體和土壤是初侵染的主要侵染源。帶病植株也是該病原長距離傳播的一個重要因素。大豆豆莢在其形成后的任何時間都可能被侵染，給大豆的生產帶來嚴重的影響。PL的寄主范圍很廣，除大豆外，還危害三葉草、綠豆、利馬豆、豌豆、花生、大蒜、洋蔥、辣椒、番茄、三裂葉豚草、蒼耳、小地錦草、皺葉酸模等。DPC、DPM、DPS、PL共同引起間座殼-擬莖點綜合癥，產生的危害超過其中任何單一真菌病害，而PL是其中最常被分離到和最為重要的一種。目前主要有PCR-RFLP等方法檢測。

大豆莖潰瘍病(Soybean?Stem?Canker，簡稱SSC)是大豆生產上的一種重要病害，病原菌分別為大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthe?phaseolorum(Cookeet?Ell)Sacc.var.caulivora?Athow?et?Caldwell，簡稱DPC)和大豆南方莖潰瘍病菌(Diaporthe?phaseolorum(Cooke?et?Ell.)Sacc.var.meridionalis?F.A.Fernandez，簡稱DPM)，這兩種病原菌都是我國重點關注進境植物檢疫對象。該病菌侵染植株后迅速發展形成莖桿環狀損傷，并可導致正在生長的植株死亡。發病嚴重的田塊有80％的植株受到侵染，產量損失高達50％，造成嚴重的經濟損失。近年來該病害發展迅速，在美國、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭、意大利、前南斯拉夫、克羅地亞等歐洲部分國家及地區有發生報道，是國外大豆生產上的重要病害。目前我國尚沒有DPM的發生報道。

總的來說，目前對于四種真菌病害的檢測方法存在諸多不足。比如形態學檢測周期長、需要豐富經驗，有的真菌采用形態學鑒定還存在較大的爭議或難以區分其近似形態的種屬；而現有的分子檢測方法操作復雜或檢測靈敏度不高、或特異性不強、或重復性不好等。并且，目前尚未有能對四種檢疫性大豆真菌病害同時進行檢測的多重檢測方法。

隨著我國對進口大豆需求的增加，各種大豆病害傳入的風險也不斷增加，對我國的大豆生產構成巨大的潛在威脅。因此，在口岸檢疫部門采用簡單、快速、特異、靈敏的檢測方法對其中具有嚴重影響的病害進行檢測，對保護我國大豆生產，防止其重要檢疫性病原真菌的傳入具有重大意義。

發明內容

本發明的目的在于提出快速、可靠、靈敏度高、特異性強和價格便宜的檢測大豆疫病菌、大豆擬莖點霉種子腐爛病菌、大豆南方莖潰瘍病菌、大豆北方莖潰瘍病菌四種大豆大豆真菌病害重要病害的引物、寡核苷酸探針、試劑盒及多重實時熒光PCR檢測方法。