[發明專利]檢測志賀菌的實時熒光PCR試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 200910098649.0
• 申請日: 2009-05-22
• 公開（公告）號: CN101792794A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 梅玲玲;朱敏;張俊彥;程蘇云;占利
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種檢測志賀菌(Shigella)的實時熒光PCR試劑盒及其 檢測方法。

(二)背景技術

志賀菌(Shigella)作為侵襲性病原菌，可直接破壞腸黏膜，引起細 菌性痢疾和食物中毒。全球每年有1.6億志賀菌患者，約有110萬人死亡。 是我國夏、秋季常見的腸道傳染病，也是傳染病防制法規定的丙類傳染病 病原菌，屬于對人類和動物健康有極大危害的一類食源性病原菌。

志賀菌目前主要通過培養法分離，生化方法鑒定，整個過程操作繁瑣， 耗時長，陽性率低。TaqMan-MGB探針熒光PCR方法是在熒光定量PCR 技術上發展起來的一種新型實時定量體外核酸擴增檢測技術，比后者具有 更好的敏感性、特異性和重復性，而且時間更縮短為2～3h以內。

(三)發明內容

本發明目的是根據志賀菌ipaH基因設計引物和TaqMan探針，提供 一種檢測志賀菌的實時熒光PCR試劑盒及檢測方法，可實現對志賀菌快 速、準確、特異檢測。

本發明采用的技術方案是：

一種檢測志賀菌(Shigella)的實時熒光PCR試劑盒，所述試劑盒主 要包括特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和 DNA聚合酶，其特征在于所述特異性引物和熒光探針序列如下：

上游引物：5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′

下游引物：5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′

熒光探針：5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′

其中FAM為熒光報告基團，MGB為熒光淬滅基團。

本發明關鍵在于特異性引物和熒光探針序列的設計及檢測方法，試劑 盒中其他組成，可按本領域常規進行選擇，該試劑盒可用作志賀菌的定性 檢測，也可加入標準菌株標準品進行定量檢測。

為達到定量檢測的效果，所述試劑盒還包括志賀菌標準菌株 (ATCC51570)的DNA標準品。以梯度濃度的志賀菌標準菌株 (ATCC51570)的DNA溶液在與樣品DNA相同條件下進行實時熒光定 量PCR擴增反應，以志賀菌標準菌株(ATCC51570)濃度的對數值為橫 坐標、Ct值為縱坐標繪制標準曲線；根據樣品測得的Ct值，對照標準曲 線，獲得樣品中志賀菌的濃度。

本發明應用新型TaqMan-MGB探針，建立的志賀菌實時PCR方法， 可直接檢測疑似病人、食品和環境中志賀菌，為志賀菌食物中毒事件快速 診斷，為迅速采取相應措施，避免任何食品來源疾病的爆發提供科學依據。

本發明一種檢測賀菌的熒光定量PCR方法，所述方法包括：

(1)按照常規方法提取待測樣品DNA；通常采用熱裂解法：將菌株 收集于1.5mL管中，置沸水浴10min，10000rpm離心5min，吸 上清至另一離心管，-40℃保存備用；

(2)以待測樣品DNA為模板，與特異性引物和熒光探針、PCR緩沖 液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反應 體系，進行PCR反應，反應產物置于定量PCR儀進行熒光檢測；

所述特異性引物和熒光探針序列如下：

上游引物：5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′

下游引物：5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′

熒光探針：5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′

其中FAM為熒光報告基團，MGB為熒光淬滅基團；

(3)擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調整取3～15個循環的熒光信 號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；若 待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數增長，CT 值小于35，則判斷為陽性，即樣本中存在志賀菌。

所述陰性對照品可按本領域常規方法選擇，通常選擇不含靶基因的非 靶細菌，如副溶血性弧菌、單增李氏菌、沙門菌等。進一步，所述方法同 時以梯度濃度的志賀菌(ATCC51570)DNA溶液在與樣DNA相同條 件下進行實時熒光定量PCR擴增反應，以志賀菌(ATCC51570)濃度的 對數值為橫坐標、Ct值為縱坐標繪制標準曲線；根據樣品測得的Ct值， 對照標準曲線，獲得樣品志賀菌的濃度。