[發明專利]海雀稗耐寒體細胞突變體篩選方法

無效

• 申請號: 200910097362.6
• 申請日: 2009-04-13
• 公開（公告）號: CN101558737A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 葉曉青;梁流芳;佘建明;張旭;董民強;王松鳳;吳瑛瑛;倪萬潮;楊莉林;吳小明
• 申請（專利權）人: 浙江紹興白云建設有限公司;江蘇省農業科學院;杭州白云草業研究所有限公司
• 主分類號: A01H1/04
• 分類號: A01H1/04;A01H4/00
• 代理公司: 浙江翔隆專利事務所
• 代理人: 胡龍祥

技術領域

本發明海雀稗耐寒體細胞突變體篩選方法，涉及一種適用于植物細胞離體培養植株再生和體細胞突變體定向篩選方法，屬于植物培養方法技術領域。

背景技術

海雀稗(Paspalum?vagina?tum?Sw.)作為草坪草，在世界熱帶與亞熱帶地區廣為種植，是繼狗牙根、結縷草和假儉草等暖季型禾草之后興起的后起之秀(解新明，盧小良.海雀稗種質資源的優良特性及其利用價值[J]，華南農業大學學報，2004，25(增刊II)：64-67)。近年來海雀稗在蘇、浙、滬地區得到推廣種植，但其綠期與當地種植的狗牙根和結縷草相比短7-25d，迫切需要提高海雀稗的耐寒性，延長綠期。三倍體的海雀稗因花粉敗育、自交不親和等障礙(馬國華，趙南先.雀稗屬細胞學和繁殖生物學研究[J]，亞熱帶植物科學，2003，32(3)：5-9)，給常規育種工作帶來困難。

植物體細胞突變體篩選技術為植物品種改良開辟了細胞和分子生物學育種新途徑。體細胞突變體篩選是在植物細胞培養過程中，結合施加相應的選擇壓進行定向誘變，有利于篩選出期望的體細胞突變體。國外一些學者以-3℃作為組織培養中誘導篩選耐寒變異的脅迫條件，在煙草、辣椒、胡蘿卜、水稻等作物上得到耐寒的愈傷組織，但最終都未能分化出再生植株(Takeuchi?M，Tetuo?N，Huruya?P.Plant?tissue?culture?technology[M].AsakuraPublishing?Co.Lid，1984，105-106；Japan?Agriculture，Forestry?andFisheries?Technology?Conference?Services?Bureau.1987，Experimentsstudy?the?achievement?book，III?68-69)。在水稻上，金潤洲等通過愈傷組織在15℃下連續繼代培養3個月，獲得了耐冷突變體材料(金潤洲，都興林，王景余，等.粳稻體細胞耐泠變異的誘導篩選技術[J].作物品種資源，1999，(2)：27-29)。；翟國堂以4℃的溫度處理愈傷組織，供試的4個品種都得到了耐寒變異株系(翟國堂.水稻變異體篩選[J].廣西農業大學學報，1996，15(3)：209-213)；Bert?in和Bouharmont則以5-10℃為選擇壓，在4個品種中獲得了耐寒突變體(Bertin?P，Bouharmont?J.Use?of?somaclonal?variationand?in?vitro?selection?forchilling?tolerance?improvement?in?rice[J].Euphycita，1997，96(1)：135-142.)。

發明內容

本發明的技術任務是以海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，溫度設置為0℃，研究低溫培養條件對愈傷組織生長和綠苗分化的影響，運用離體培養技術從耐寒突變細胞再生出植株，建立海雀稗耐寒體細胞突變體篩選方法，獲得海雀稗耐寒突變體植株。為此，本發明采用以下技術方案：

1、海雀稗耐寒體細胞突變體篩選方法，其特征是：

1)材料

選用海雀稗的顆粒狀胚性愈傷組織為材料，0℃為低溫篩選壓；

2)培養基

基本培養基由MS大量元素、MS微量元素與B₅維生素組成，添加蔗糖30g/L；

愈傷組織繼代培養基：是在基本培養基中附加以下激素組成：2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L，6-芐基氨基嘌呤0.05mg/L，瓊脂條16g/L；

愈傷組織分化培養基：是在基本培養基中附加以下激素組成：6-芐基氨基嘌呤2.0mg/L，瓊脂條8g/L；

上述培養基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調整pH值至5.8；

3)方法

將顆粒狀胚性愈傷組織在愈傷組織繼代培養基上進行增殖培養，用作低溫處理材料；冰箱溫度設置為0℃，低溫培養時間分別為60d；經過低溫培養和篩選的愈傷組織轉移到愈傷組織分化培養基上形成綠苗；綠苗再轉移到愈傷組織分化培養基上，發育成具有根、莖、葉的完整再生植株。

作為對上述技術方案的進一步完善和補充，本發明還包括以下附加的技術特征，以便在實施時根據需要選用：

所述的愈傷組織繼代培養在散射光下進行。

所述的愈傷組織低溫培養在無光源的冰箱內進行。

所述的愈傷組織分化在光照條件下進行。

所述的培養室溫度為26±2℃，光照強度為1500lx，光照時間為16h/d。

本發明與現有技術相比具有如下優點和積極效果：