[發明專利]一種耐高溫β-半乳糖苷酶及其編碼基因與應用

無效

• 申請號: 200910090497.X
• 申請日: 2009-08-13
• 公開（公告）號: CN101993864A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 江正強;張敏;波麗特;宋春雷;李里特
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N15/56;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/00;C12N15/11;C12P19/14
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種耐高溫β-半乳糖苷酶及其編碼基因與應用。

背景技術

β-半乳糖苷酶又稱β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside?galacto-hydrose，EC?3.2.1.23)，商品名為乳糖酶。該酶能催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷鍵發生水解，有些種類的β-半乳糖苷酶具有構型保持酶的作用機制，在水解乳糖分子的同時，還具有轉半乳糖基的作用，即以乳糖或其水解產物半乳糖和葡萄糖為糖基受體，生成半乳糖苷鍵，被用于合成功能性低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶可廣泛應用于食品、制藥、免疫、疾病診斷及環境檢測等方面。例如，在食品行業中，β-半乳糖苷酶可以用于水解牛乳和其它乳制品中的乳糖；在乳味面包制作中，添加β-半乳糖苷酶，能增加面包甜度，提高酵母產氣量，使面包更加膨脹，而且水解乳中的半乳糖有利于褐變，可以改善面包的色澤。另外，β-半乳糖苷酶可以牛乳或乳清中的乳糖為底物，水解并轉糖苷得到低聚半乳糖。在制藥業中，β-半乳糖苷酶作為酶類藥物，適用于嬰兒的各種消化不良癥。在環境檢測方面，大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶活性檢測可以用于快速分析浴場和漁場地區海水水體受排泄物污染的程度。

國內對β-半乳糖苷酶的研究起步較晚，是20世紀80年代以后才開始的。主要工作集中在β-半乳糖苷酶產生菌的篩選、發酵工藝的研究、酶的提取純化和酶學性質研究等方面。近年來開始利用基因克隆等方法研究β-半乳糖苷酶的重組表達。例如，王元火等將環狀芽孢桿菌中的β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中表達后，Km比原始酶小285倍，Vmax比原始酶大5.4倍(王元火，姚斌，袁鐵錚，操時樹，張偉，王亞茹，范云六.環狀芽孢桿菌乳糖酶基因在大腸桿菌中的表達及酶學性質分析.農業生物技術學報，2003，11(1)：83-88.)。劉愛兵等將乳酸克魯維酵母中的β-半乳糖苷酶基因在畢赤酵母中表達，胞內外均檢測到酶活(劉愛兵，張偉，李名揚.乳酸克魯維斯酵母乳糖酶基因的克隆及原核表達.西南農業大學學報(自然科學版)，2004，26(5)：636-639.)。張灝等將嗜熱脂肪芽孢桿菌中的耐熱β-半乳糖苷酶基因克隆到枯草芽孢桿菌穿梭質粒pMA5中，比酶活是原來的2倍(張灝，夏雨，傅曉燕，陳衛，丁霄霖.耐熱β-半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢桿菌中的整合表達.無錫輕工業大學學報，2003，22(6)：1-4.)。段文娟等以嗜熱古細菌Pyrococcus?furiosus的基因組DNA為模板，克隆獲得乳糖酶基因celB，將celB基因插入到表達載體pET-30a(+)中并轉化大腸桿菌BL21，celB基因在大腸桿菌中獲得高效表達；乳糖酶基因celB表達的乳糖酶蛋白CELB的分子質量約為58kDa，CELB是耐高溫酶(段文娟，楊嬌艷，李卓夫，張偉，張志芳.來源于嗜熱古細菌Pyrococcus?furiosus乳糖酶基因的原核表達及酶學性質分析.中國農業科技導報，2008，10(02)76-81.)。龔月生等將來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的耐熱β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大腸桿菌pET表達系統(pET-28a(+))中，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達；該重組耐熱β-半乳糖苷酶的最適反應溫度為65℃(龔月生，劉錦妮，王晶，楊明明，袁新宇.耐熱β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中的表達及酶學性質研究.西北農林科技大學學報(自然科學版)，2008，36(10)，59-66.)。張敏等研究了在大腸桿菌中克隆和表達海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)MSB8的一個β-半乳糖苷酶基因(BgalB)(張敏，江正強，唐犖，叢倩千，李里特.海棲熱袍菌耐高溫β-半乳糖苷酶基因的克隆和表達.微生物學通報，2008，35(4)，507-511.)。專利號為ZL95107176.9的專利中公開了一種分離自Pyrococcusfuriosus的耐SDS的高熱穩定性β-半乳糖苷酶基因。專利號為200610001785.X的專利中公開了一種耐高溫乳糖酶的制備方法，是將耐高溫乳糖酶基因構建到桿狀病毒運載載體上，得到重組桿狀病毒運載載體；通過體內或體外重組，將耐高溫乳糖酶基因整合到桿狀病毒的基因組上，得到重組桿狀病毒；用所得到的重組桿狀病毒感染昆蟲宿主；培養被感染的昆蟲宿主使其進行耐高溫乳糖酶的表達。