[發明專利]一種制備酰基-L-肉堿和/或L-肉堿的方法

無效

• 申請號: 200910086613.0
• 申請日: 2009-06-12
• 公開（公告）號: CN101921814A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 王強;田金強;張鐘元
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農產品加工研究所
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種制備酰基-L-肉堿和/或L-肉堿的方法。

背景技術

L-肉堿被廣泛應用于醫藥工業、食品工業和飼料工業。目前，生產L-肉堿的方法主要有提取法、化學合成法和生物催化法。其中，具有商業化價值的是化學合成法和生物催化法。生物催化法較化學合成法具有環境友好、低成本、產品安全性高等特點，發展前景較好。

巴豆甜菜堿在肉堿脫水酶催化下合成L-肉堿是制備L-肉堿的重要途徑之一，也是目前采用生物催化法生產L-肉堿的主要方法。但是以巴豆甜菜堿為前體制備L-肉堿的方法存在以下問題：(1)前體轉化率低。為了提高前體轉化率，許多研究正在進行，包括高密度細胞發酵技術、固定化細胞技術、基因育種技術以及上述技術的集成。但目前轉化率僅達到42％的野生菌(Cánovas?M，Bernal?V，González?M.Factors?affecting?the?biotransformation?of?trimethylammonium?compounds?into1-carnitine?by?Escherichia?coli[J].Biochemical?Engineering?Journal，2005，26：145-154.)和轉化率達到70％的重組菌(Castellar?MR，Obón?JM，Marín?A.L(-)-carnitine?production?using?a?recombinant?Escherichia?coli?strain[J].Enzyme?and?Microbial?Technology，2001，28：785-791.)，嚴重影響了其市場競爭力，為此國內相關企業被迫停產。(2)產物和前體難以分離。以巴豆甜菜堿為前體的L-肉堿制備方法中，產物分離和純化的關鍵技術是如何分離物化性質極其接近的未轉化的巴豆甜菜堿和產物L-肉堿。孫志浩等(孫志浩.生物催化工藝學[M].北京：化學工業出版社，2005：503-532.)采用亞硫酸鹽和巴豆甜菜堿發生加成反應的方法實現了巴豆甜菜堿和L-肉堿的分離，但存在巴豆甜菜堿不能回收利用的問題。此外，從我國肉堿工業的發展狀況來看，還存在酰基-L-肉堿產品種類較少的問題。

目前，我國在L-肉堿的制備方面進行了一些工作：如1996年，孫志浩等通過UV和⁶⁰Co誘變得到E.coli?CGMCC0276，采用分批轉化培養E.coli?CGMCC0276可以使L-肉堿的產量達到15g/l以上，最高達到21.5g/l，且巴豆甜菜堿的轉化率達到40％，最高達到42％；該方法還采用亞硫酸鹽法將未轉化的巴豆甜菜堿和L-肉堿相分離(孫志浩.生物催化工藝學[M].北京：化學工業出版社，2005：503-532.)。2000年，王玉萍等通過溴化乙錠誘變，得到一株大腸桿菌突變株，該突變株轉化巴豆甜菜堿的最高轉化率為40％(王玉萍，譚訓剛，陳師勇等.肉堿脫水酶突變株的獲得及其休止細胞反應條件的優化[J].生物技術通訊，2000(4)：261-263.)。2001年，呂忠等篩選出菌株E.coli?K74，該菌株在最適條件轉化巴豆甜菜堿的最大轉化率達20.3％(呂忠，王玉萍，李翔太等.產L-肉堿的菌種篩選及發酵條件優化[J].微生物學雜志，2001(1)：4-6.)。2002年，范立強等分別構建caiB基因和caiE基因的表達質粒pET28caiB和pET22caiE，利用雙抗生素篩選法，獲得能穩定遺傳的雙質粒轉化子；經IPTG誘導，這兩個基因可以在大腸桿菌中共表達，其表達量分別占菌體總蛋白的39％和20％；共轉化菌中，肉堿脫水酶的酶活力比pET28caiB單轉化菌提高了2.3倍(范立強，袁勤生，吳祥甫.大腸桿菌caiE基因的克隆與高效表達[J].華東理工大學學報，2002，28(2)：149-152.)。在酰基-L-肉堿的酶催化合成方面，中山大學和中山尤利卡天然藥物有限公司于2007年以乙腈和無溶劑體系作為反應介質合成了共軛亞油酰-L-肉堿，其制備工藝已獲得國家發明專利。