[發明專利]一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應用

有效

• 申請號: 200910085530.X
• 申請日: 2009-05-25
• 公開（公告）號: CN101560245A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 高福;孫業平
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12N15/44;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/00;A61K39/145;A61K48/00;A61P31/16;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應用。

背景技術

人禽流感H5N1病毒是一種來源于禽類的高致病性、高致死率的流感病毒亞型。 1997年在香港首先爆發了人禽流感的感染，18人感染，其中6人死亡。到2003年， 世界范圍內又重新出現了人禽流感病例。從2003年底至今，已有408例感染，其中 205例死亡。人禽流感的傳播方式一般是從禽類傳染給人，人和人之間的直接傳染只 是偶發現象。但是，一旦病毒通過突變或者與人流感病毒基因發生重排，就可能產生 適應在人體復制和人與人直接傳播的新毒株，導致流感大流行。雖然目前沒有觀察到 H5N1病毒持續的人到人的傳播，但是20世紀的3次流感大流行都起源于鳥類的流感 病毒，其中1918-1919年流感大流行奪去了四千萬人口的生命。據估計，下一次流感 大流行造成的死亡數字將遠高于此。因此，為應對流感大流行做準備是十分緊迫的任 務。

機體的免疫系統是抵御病毒入侵的重要紡線，研制高效的疫苗，激發人體的保護 性免疫反應是防治高致病性禽流感最重要的手段。機體的免疫系統有體液免疫和細胞 免疫兩個分支。體液免疫是由抗體介導的。流感病毒通過其血凝素(HA)糖蛋白結合 細胞表面的唾液酸殘基而粘附在宿主細胞表面，再通過內吞作用以及隨后的病毒囊膜 和宿主細胞膜的融合而進入細胞。病毒HA對于流感病毒致病力和病毒感染的宿主范 圍起著關鍵的作用，同時HA也是體液免疫的主要靶抗原。HA特異性抗體起著阻斷病 毒粘附的作用，從而抑制病毒感染細胞。

與體液免疫不同，細胞免疫是由細胞毒性T淋巴細胞(CTL)所介導的。病毒感 染細胞后，病毒蛋白質被細胞內的蛋白酶分解成多肽，被轉運到內質網中，再被裝載 到主要組織相容性復合體(MHC)I類分子上。然后多肽-MHC復合物通過高爾基體被 轉運到細胞表面，再被CTL(CD8⁺T細胞)識別。CTL識別MHC分子提呈的病毒多肽 后，分泌具有抗病毒活性的細胞因子，如IFN-γ和TNF-α，以及具有裂解細胞作用 的穿孔素，從而殺傷被病毒感染的細胞，限制病毒的復制和傳播，進而清除病毒。這 些被CTL識別的病毒多肽就是相應的MHC限制性的CTL表位。細胞免疫雖然可能不能 預防病毒感染細胞，但是可以通過清除被病毒感染的細胞防止流感病毒導致的嚴重疾 病和死亡。

目前禽流感H5N1的檢測方法包括病原學方法、血清學方法和核酸檢測方法。

通過病毒的分離鑒定是禽流感的經典病原學方法。該方法檢測結果準確可靠、靈 敏(極少量病毒也可檢出)，但操作程序繁雜、費用高、實驗室要求高(國家規定必 須在P3級實驗室進行)、耗時費力、周期長(檢測時間需1-3周)，大面積應用推廣受 到較大限制。

目前共有6種血清學檢測技術，分別是：血凝抑制試驗(HI)、微量中和試驗(MNT)、 免疫熒光技術(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金免疫層析分析(GICA)和蛋 白免疫印跡(western?blot)。這些方法都是利用抗原抗體之間的特異性反應，來確定 病毒亞型或者某種亞型特異性抗體的滴度。血凝抑制試驗和瓊脂擴散實驗操作簡便快 速，但靈敏度較低。微量中和試驗雖然靈敏度高，但操作繁瑣耗時。免疫熒光技術靈 敏度高，但需要復雜昂貴的儀器設備，應用受到限制。酶聯免疫吸附試驗一般被認為 是既簡便快捷，又靈敏的方法，但是用于檢測抗體時，對抗原制備的要求較高。在這 6種檢測技術中，血凝抑制試驗和微量中和試驗是實驗室常規方法，其余4種對于常規 流感甲1和甲3亞型已有完善的方法，但是用于H5抗原的檢測還需改進和優化。對于膠 體金免疫層析分析，日本、美國和我國有區別甲型流感、乙型流感和H5亞型的試劑盒， 敏感度不夠高。

禽流感病毒的核酸檢測技術包括反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和實時定量 PCR(RTQ-PCR)。該方法不但可鑒定樣品中病毒的型及亞型，還可結合基因序列分析推 測病毒的致病力高低。其靈敏度高，較病毒分離法快速、特異性也高，是公認的能夠 在較短時間做出準確診斷的方法。但其成本較高，試驗過程復雜，對實驗環境、儀器 設備、操作人員等要求高，同時干擾因素多，會出現假陰性或假陽性現象，診斷時不 能作為唯一的判定依據。