[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)類(lèi)鼻疽的基因液相芯片及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910080261.8
• 申請(qǐng)日: 2009-03-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101560561A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王靜;宋亞軍;文海燕;楊宇;孫肖紅;胡孔新;劉衡川
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64;C12R1/01
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽(yáng)光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 尹振啟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)類(lèi)鼻疽(Burkholderia?pseudomallei，B.p)的基因液相 芯片及其制備方法。本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯片進(jìn)行檢測(cè)的 方法。

背景技術(shù)

液相芯片檢測(cè)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新興技術(shù)，具有快速、特異、敏 感的特點(diǎn)。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的 微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏 色，作為100種獨(dú)特的色彩編號(hào)，每顆微球大小約5.5μm，可依不同研究 目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識(shí)別分析等，并根據(jù) 不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。

類(lèi)鼻疽菌為革蘭陰性，雙極，需氧，有動(dòng)力，棒狀無(wú)芽孢桿菌。類(lèi) 鼻疽菌引起熱帶和亞熱帶地區(qū)人和動(dòng)物的類(lèi)鼻疽病，感染人可通過(guò)過(guò)呼 吸道、皮膚等多途徑進(jìn)入人體內(nèi)，潛伏期一般為3～5天，少數(shù)也有數(shù)年 后發(fā)病，即所謂“潛伏型類(lèi)鼻疽”，甚至20年以上。本病有急性敗血癥 型、亞急性、慢性及亞臨床型3種表現(xiàn)，臨床癥狀不典型，不易診斷。 亞急性或慢性類(lèi)鼻疽典型表現(xiàn)是類(lèi)似結(jié)核病的肺葉空洞，急性敗血癥患 者常伴多處化膿性損害，病情一般較為嚴(yán)重，如不及時(shí)治療，病死率很 高。

應(yīng)用傳統(tǒng)的培養(yǎng)、生化鑒定的方法對(duì)類(lèi)鼻疽做出診斷通常需要1周的 時(shí)間才能獲得結(jié)果，且往往導(dǎo)致鑒定錯(cuò)誤。利用直接免疫熒光、膠乳凝 集、ELISA等免疫學(xué)方法對(duì)培養(yǎng)物或標(biāo)本中的抗原、外毒素等進(jìn)行檢測(cè)特 異性和敏感性都較好。分子生物學(xué)方法檢測(cè)類(lèi)鼻疽菌已見(jiàn)諸多報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的基因液相芯片及其制備方法，該基因液相芯 片可以用于病原體類(lèi)鼻疽的檢測(cè)。本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯 片進(jìn)行檢測(cè)的方法。

經(jīng)過(guò)深入和大量的研究和實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明以類(lèi)鼻疽染色體標(biāo)識(shí)序列為 靶序列，建立了類(lèi)鼻疽的基因液相芯片和檢測(cè)方法，為該菌的檢測(cè)提供 一條可行的途徑。

本發(fā)明所述的基因液相芯片包括：微球、捕獲探針、引物、PCR反 應(yīng)體系、鏈親和素-藻紅蛋白，該基因液相芯片可檢測(cè)類(lèi)鼻疽。

本發(fā)明還涉及上述可檢測(cè)類(lèi)鼻疽的基因液相芯片，該芯片包括：熒 光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應(yīng)體系、鏈親和素-藻紅蛋白。

本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq?DNA聚 合酶。

本發(fā)明的引物包括：

其中，下游引物是5’生物素標(biāo)記的Bp-R。

具體例如是Bp-R：5’-生物素-CCCCAGTTCATCTGATACTTGC

本發(fā)明的捕獲探針，所述的捕獲探針具有特異性：

??探針 ??名稱(chēng) ??探針靶位 ??探針序列(5’-3’) ??Bp ??類(lèi)鼻疽染色體標(biāo)識(shí)序列 ??209-231bp ??AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT

本發(fā)明中，上面所述捕獲探針在合成時(shí)在5’端進(jìn)行氨基修飾，并且 連接15-20個(gè)T或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球 進(jìn)行偶聯(lián)。

本發(fā)明的微球，一般選擇熒光編碼的微球，例如來(lái)源于Luminex或 其他代理公司的任何編號(hào)的微球，特異性探針與熒光編碼微球偶聯(lián)形成 檢測(cè)微球，由此構(gòu)成檢測(cè)芯片。