[發(fā)明專利]一種提取植物脂筏的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910080002.5
• 申請(qǐng)日: 2009-03-16
• 公開（公告）號(hào): CN101508935A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林金星;李瑞麗;陳彤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院植物研究所
• 主分類號(hào): C11B1/00
• 分類號(hào): C11B1/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān) 暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提取植物脂筏的方法。

背景技術(shù)

Simons等在1997年發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜中具有富含膽固醇和鞘脂類(鞘磷脂和鞘糖脂)的微區(qū)，稱為“脂筏”。近幾年來(lái)，在擬南芥、煙草和苜蓿等植物中也發(fā)現(xiàn)存在類似的質(zhì)膜微區(qū)(membrane?microdomain)。脂筏的大小約為70nm，是一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，位于質(zhì)膜的外小頁(yè)上。由于鞘磷脂具有較長(zhǎng)的飽和脂肪酸鏈，分子間的作用力較強(qiáng)，所以這些區(qū)域結(jié)構(gòu)致密，介于無(wú)序液體與液晶之間，稱為有序液體(Liquid-ordered)。在低溫下這些區(qū)域能抵抗非離子去垢劑的抽提，所以又稱為抗去垢劑膜(detergent-resistant?membranes，DRMs)。

脂筏的組分和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有利于蛋白質(zhì)之間相互作用和構(gòu)象轉(zhuǎn)化，可以參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。脂筏主要具有如下功能：(1)由于脂筏內(nèi)有多種信號(hào)分子，它可以參與許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；(2)可以參與細(xì)胞蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)，脂筏內(nèi)包含許多的受體蛋白，故利用不同的途徑運(yùn)送這些受體蛋白進(jìn)入細(xì)胞；(3)脂筏的另一功能是通過與微絲相關(guān)聯(lián)而影響細(xì)胞骨架的組織。脂筏的研究已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的熱門研究領(lǐng)域之一。目前，植物中脂筏的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于哺乳動(dòng)物和酵母。迄今為止，只有關(guān)于植物質(zhì)膜的提取和純化方法，但進(jìn)一步提取植物脂筏的方法尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種提取植物脂筏的方法。

本發(fā)明所提供的提取植物脂筏的方法，包括以下步驟：

1)裂解植物質(zhì)膜，得到裂解液；

2)將上述步驟1)的裂解液進(jìn)行密度梯度離心，得到植物脂筏。

上述方法中，所述步驟1)中，用Triton?X-100裂解植物質(zhì)膜，得到裂解液；

所述植物質(zhì)膜和Triton?X-100混合后，混合液中Triton?X-100的終濃度為0.5-1.5％，具體可為1％。

所述裂解的時(shí)間為20-40min；所述裂解的溫度為0-10℃，具體可為4℃。

上述方法中，所述步驟2)中，所述密度梯度離心的介質(zhì)具體可為蔗糖。

所述密度梯度離心的條件為4℃、200,000-300,000g、離心17-19h，具體可為250,000g，離心18h。

實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可將蔗糖用TNE緩沖液配制成質(zhì)量百分含量分別為60％、40％、35％、30％和5％的濃度梯度，將上述步驟1)的裂解液與質(zhì)量百分含量為60％的蔗糖溶液混合，使混合溶液中蔗糖的終濃度為48％，再依次加入質(zhì)量百分含量分別為40％、35％、30％和5％的蔗糖溶液，這樣就形成了一系列蔗糖濃度梯度。上述步驟1)的裂解液在上述濃度梯度的蔗糖溶液中密度梯度離心后，在質(zhì)量百分含量為30％和35％的蔗糖溶液界面上出現(xiàn)了一條不透明的條帶，即為植物脂筏。

上述提取植物脂筏的方法還包括將所述植物脂筏用TNE緩沖液洗滌，除去蔗糖的步驟。

所述TNE緩沖液的組成為：20-30mM?Tris-cl、150mM?NaCl、5mM?EDTA；

所述TNE緩沖液的pH為7.4-7.6，具體可為7.5。

上述方法中，所述植物質(zhì)膜的提取方法包括以下步驟：

1)取植物組織在40-60mM的MOPS緩沖液中打碎，收集上清液；

所述MOPS緩沖液的組成為：40-60mM?3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、0.33M蔗糖、10％質(zhì)量百分含量丙三醇、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2％質(zhì)量百分含量酪蛋白、0.6％質(zhì)量百分含量聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、5mM二硫蘇糖醇(DTT)和5mM抗壞血酸，所述各物質(zhì)的濃度為它們?cè)谒鯩OPS緩沖液中的終濃度；

2)取上述步驟1)的上清液，加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，9,000-11,000g離心10-20min，收集上清液；

3)取上述步驟2)的上清液，40,000-60,000g離心40-60min，得到微粒體；

4)在上述步驟3)的微粒體中加入4-6mM的磷酸鉀懸浮液和苯甲基磺酰氟(PMSF)，得到微粒體懸浮液；

所述磷酸鉀懸浮液的組成為：4-6mM磷酸鉀緩沖液、330mM蔗糖、0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1mM二硫蘇糖醇(DTT)，所述各物質(zhì)的濃度為它們?cè)谒隽姿徕洃腋∫褐械慕K濃度；

5)將上述步驟4)的微粒體懸浮液與兩相混合液混合，1,000-2,000g離心4-6min，收集上清液；