[發(fā)明專利]一種提取裸子植物組織中RNA的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910079897.0
• 申請(qǐng)日: 2009-03-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101492485A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張凌云;于彥麗;鄭成超;李彥澤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué);山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07H21/02
• 分類號(hào): C07H21/02;C07H1/08;C12N15/10
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān) 暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提取樹(shù)木類植物組織中RNA的方法，特別涉及一種提取裸子植 物組織中RNA的方法。

背景技術(shù)

裸子植物和被子植物同屬于種子植物，作為地球上的重要植物類群，裸子植物 在進(jìn)化史上更原始，具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，花粉管生長(zhǎng)緩慢、易分叉等特點(diǎn)，因而被認(rèn) 為具有不同于被子植物花粉發(fā)育的獨(dú)特發(fā)育模式而逐漸受到重視。裸子植物與人類 生產(chǎn)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)建設(shè)休戚相關(guān)，具有較高的生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)于維持全球 的生態(tài)平衡，改善環(huán)境污染具有十分重要的作用。裸子植物多為重要林木，尤其在 北半球，大的森林80％以上是裸子植物，是很好的建筑、車船、造紙用材。因此開(kāi) 展裸子植物生長(zhǎng)發(fā)育及代謝、抗逆等相關(guān)的各種分子機(jī)制研究和林木生物技術(shù)發(fā)展 與應(yīng)用研究就顯得尤為必要。

相對(duì)于一年生植物而言，樹(shù)木類植物組織中酚類和多糖等次生物質(zhì)含量較多， 且該類物質(zhì)對(duì)RNA的分離和純化有很大干擾，嚴(yán)重影響了提取RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量， 導(dǎo)致林木尤其裸子植物分子生物學(xué)研究明顯滯后。研究裸子植物生長(zhǎng)發(fā)育及代謝、 抗逆等相關(guān)的各種分子機(jī)制以及林木轉(zhuǎn)基因研究，均涉及到其組織中RNA的提取。 但由于裸子植物遺傳背景的復(fù)雜性及分子操作上的實(shí)際困難導(dǎo)致裸子植物分子生 物學(xué)和基因工程包括林木抗性、生殖發(fā)育、材性改良等明顯落后。目前，RNA的提 取方法很多，采取Trizol試劑盒、SDS、常規(guī)CTAB等方法均不能有效地從木本裸 子植物組織中提取高質(zhì)量的RNA。迄今為止還沒(méi)有提取木本裸子植物各種組織中高 質(zhì)量RNA的有效方法和技術(shù)，從而導(dǎo)致與裸子植物相關(guān)的分子生物學(xué)研究和生物技 術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用相對(duì)于被子植物和一年生作物滯后許多。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種提取裸子植物組織中RNA的方法。

本發(fā)明所提供的方法包括以下步驟：

1)裂解細(xì)胞釋放內(nèi)含物；

2)去蛋白：用氯仿/異戊醇抽提步驟1)得到的混合液，收集上清液；

3)沉淀RNA和回溶RNA：將步驟2)得到的上清液中的RNA沉淀，然后回溶RNA；

4)去除多糖：將步驟3)得到的回溶溶液去除多糖成分；

5)再次沉淀RNA和回溶RNA：將步驟4)得到的溶液中的RNA沉淀，然后回溶 RNA。

為了更好地純化RNA，去除DNA污染，還可在步驟5)后進(jìn)行進(jìn)一步純化RNA 的步驟，包括以下步驟：

a)去除DNA：將無(wú)RNase污染的DNase加入到步驟5)得到的回溶溶液中；

b)去除DNase：將步驟a)得到的溶液用氯仿/異戊醇抽提，離心收集上清液；

c)再次沉淀RNA和回溶RNA：將步驟b)得到的溶液中的RNA沉淀，清洗沉淀、 干燥，回溶。

為了清除蛋白，步驟2)可重復(fù)1-2次。

為了進(jìn)一步清除蛋白，在步驟4)之后，步驟5)之前，可再次去除蛋白：將 步驟4)得到的上清液經(jīng)氯仿/異戊醇抽提，然后離心，收集上清液。

上述氯仿/異戊醇體積比為24∶1。

步驟1)裂解細(xì)胞釋放內(nèi)含物，可用液氮將植物材料速凍研磨后，加入預(yù)熱過(guò) 的RNA提取緩沖液，迅速渦旋，放回水浴中溫浴。

所述RNA提取緩沖液含有濃度為80-120mmol/L，pH?8.0的Tris?HCl、1-3g/100ml CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)、1-3g/100ml?PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、1.3-2.5mol/L NaCl、20-30mmol/L?EDTA，使用前加入終濃度為5-15mmol/L二硫蘇糖醇和終濃度 為1-3％(體積百分比)的β-巰基乙醇。

所述RNA提取緩沖液含有濃度為90-110mmol/L，pH?8.0的Tris?HCl、 1.5-2.5g/100ml?CTAB、1.5-2.5g/100ml?PVP、1.4-2.3mol/L?NaCl、23-27mmol/L EDTA，使用前加入終濃度為10mmol/L二硫蘇糖醇和終濃度為2％(體積百分比)的 β-巰基乙醇。

步驟3)中的所述沉淀RNA和回溶RNA是往步驟2)中得到的上清液中加入LiCl， 過(guò)夜，離心，回收沉淀，洗滌沉淀，干燥，回溶；其中LiCl的終濃度為1.5-2.5mol/L， 在4℃下放置8-16小時(shí)。