[發明專利]一種提取裸子植物組織中RNA的方法

無效

• 申請號: 200910079897.0
• 申請日: 2009-03-13
• 公開（公告）號: CN101492485A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 張凌云;于彥麗;鄭成超;李彥澤
• 申請（專利權）人: 北京林業大學;山東農業大學
• 主分類號: C07H21/02
• 分類號: C07H21/02;C07H1/08;C12N15/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢

1.一種提取裸子植物組織中RNA的方法，包括以下步驟：

1)裂解細胞釋放內含物；

所述裂解細胞釋放內含物是用液氮將植物材料速凍研磨后，加入預熱過的RNA提 取緩沖液，迅速渦旋，放回水浴中溫浴，所述RNA提取緩沖液含有濃度為80-120mmol/L， pH?8.0的Tris?HCl、1-3g/100mlCTAB、1-3g/100mlPVP、1.3-2.5mol/LNaCl、20-30mmol/L EDTA，使用前加入終濃度為5-15mmol/L二硫蘇糖醇和終濃度為1-3％(體積百分比) 的β-巰基乙醇；

2)去蛋白：用氯仿/異戊醇抽提步驟1)得到的混合液，收集上清液；

3)沉淀RNA和回溶RNA：將步驟2)得到的上清液中的RNA沉淀，然后回溶RNA；

4)去除多糖：將步驟3)得到的回溶溶液去除多糖成分；

5)再次沉淀RNA和回溶RNA：將步驟4)得到的溶液中的RNA沉淀，然后回溶RNA；

所述方法還包括在步驟5)后進行進一步純化RNA的步驟，包括以下步驟：

a)去除DNA：將無RNase污染的DNase加入到步驟5)得到的回溶溶液中；

b)去除DNase：將步驟a)得到的溶液用氯仿/異戊醇抽提，離心收集上清液；

c)再次沉淀RNA和回溶RNA：將步驟b)得到的溶液中的RNA沉淀，清洗沉淀、 干燥，回溶。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2)重復1-2次。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：在步驟4)之后，步驟5)之前， 再次去除蛋白：將步驟4)得到的上清液經氯仿/異戊醇抽提，然后離心，收集上清液。

4.如權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述氯仿/異戊醇體積比均為 24∶1。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3)中的所述沉淀RNA和回溶 RNA是往步驟2)中得到的上清液中加入LiCl，在4℃下放置8-16小時，離心，回收 沉淀，洗滌沉淀，干燥，回溶；其中LiCl的終濃度為1.5-2.5mol/L。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟4)中的去除多糖是將多糖去 除液加入到步驟3)得到的回溶溶液中，放入冰浴中沉淀多糖，然后離心，收集上清 液；其中，多糖去除液包括無水乙醇和醋酸鉀，無水乙醇在反應體系中終濃度為 10％-30％(體積百分比)，醋酸鉀的終濃度為0.4-0.6mol/L。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟5)或步驟c)用RNA沉 淀液來沉淀RNA，所述RNA沉淀液包括無水乙醇和醋酸鉀，其中無水乙醇在反應體系 中終濃度為60-80％(體積百分比)，醋酸鉀的終濃度為0.4-0.6mol/L。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述裸子植物為松杉綱松科植物， 所述松杉綱松科植物為青桿或白皮松。