[發(fā)明專利]人Kappa阿片受體1的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910077909.6
• 申請(qǐng)日: 2009-02-03
• 公開（公告）號(hào): CN101497889A
• 公開（公告）日: 2009-08-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉可為;賴超華;余木;田長(zhǎng)麟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān) 暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及人Kappa阿片受體1的制備方法。

背景技術(shù)

人Kappa阿片受體1(Kappa?Opioid?Receptor，KOR1)，是Kappa阿片受體的一種亞型。Kappa阿片受體主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在外周神經(jīng)系統(tǒng)、小腸和心臟等器官中也有分布。阿片受體能夠被一些阿片肽類的內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)質(zhì)所激活，進(jìn)而激活一系列下游信號(hào)通路，對(duì)疼痛有重要的調(diào)控作用。其中Kappa阿片受體的生理功能主要是參與鎮(zhèn)痛，且與神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，另外也參與心臟功能的調(diào)節(jié)過程。雖然對(duì)阿片受體的研究已有20多年的歷史和經(jīng)驗(yàn)積累，它們的許多藥理特性也已逐漸清晰，但由于阿片受體是一種膜蛋白，其表達(dá)和純化極為困難，故對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能所知甚少。目前的研究主要集中在阿片受體的分子克隆領(lǐng)域(阿片受體克隆研究新進(jìn)展3，孫越，臧夢(mèng)維，劉景生，中國藥理學(xué)通報(bào)(ChinesePharmacological?Bulletin?1999Dec；15(6)：497～500))和阿片受體的選擇性激動(dòng)劑和抑制劑的藥物研發(fā)領(lǐng)域。因此，本領(lǐng)域迫切需要一種體外高效表達(dá)和純化人KOR1蛋白的方法，以便能夠大量生產(chǎn)供科學(xué)研究和藥物設(shè)計(jì)所用的KOR1蛋白，以便用于KOR1蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，或進(jìn)行藥物成癮實(shí)驗(yàn)，促進(jìn)人們對(duì)該受體結(jié)構(gòu)的了解，促進(jìn)人們對(duì)藥物成癮機(jī)制的理解，為研制無副作用的鎮(zhèn)痛藥物提供新的線索，為治療藥物成癮提供新的思路，對(duì)進(jìn)一步探索KOR1蛋白重要的生物學(xué)功能將具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備人Kappa阿片受體1的方法。

本發(fā)明所提供的制備人Kappa阿片受體1蛋白的方法，包括如下步驟：將人Kappa阿片受體1蛋白的編碼基因插入pET系列載體的多克隆位點(diǎn)，得到含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體，再將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，得到含有所述編碼基因的重組菌，培養(yǎng)所述重組菌，得到人Kappa阿片受體1蛋白。

其中，所述培養(yǎng)包括如下步驟：將所述重組菌先在37℃條件下培養(yǎng)至菌液的OD₆₀₀值為0.65，再在12℃條件下培養(yǎng)至菌液的OD₆₀₀值為0.95，然后用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

所述培養(yǎng)還可在振蕩條件下進(jìn)行，所述振蕩的轉(zhuǎn)速為225轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)半徑為26mm；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為48-60小時(shí)。

所述重組表達(dá)載體具體可以是通過將所述編碼基因插入載體pET21b的多克隆位點(diǎn)得到的；所述編碼基因的核苷酸序列具體可如序列表中序列1所示。

所述培養(yǎng)用到的培養(yǎng)基的組成為：Na₂HPO₄?6.0g/L；KH₂PO₄?3.0g/L；NaC?l?0.5g/L；蔗糖4.0g/L；NH₄Cl?1.0g/L；CaCl₂?0.0111g/L；MgSO₄?0.12g/L；氨芐青霉素50mg/L，其余為水。

本發(fā)明的制備蛋白的方法還包括如下步驟：取上述誘導(dǎo)培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)液，將所述培養(yǎng)液中的細(xì)胞破碎，棄沉淀取上清液，再進(jìn)行親和層析過濾，收集洗脫峰，得到人Kappa阿片受體1蛋白；所述親和層析過濾的方法包括如下步驟：依次用洗滌緩沖液1、洗滌緩沖液2和洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集所述洗脫緩沖液洗脫下來的洗脫峰；

所述洗滌緩沖液1包括：0.2％?AZ316，20mM?Tris，200mM?NaCl，1.4mM?β巰基乙醇，其余為水；所述洗滌緩沖液1的pH值為8.0；

所述洗滌緩沖液2包括：0.2％?AZ316，30mM咪唑，20mM?Tris，200mM?NaCl，1.4mM?β-巰基乙醇，其余為水；所述洗滌緩沖液2的pH值為8.0；

所述洗脫緩沖液包括：0.2％?AZ316，200mM咪唑，20mM?Tris，200mM?NaCl，1.4mM?β-巰基乙醇，其余為水；所述洗脫緩沖液的pH為8.0；

所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。

在所述細(xì)胞破碎前，向所述培養(yǎng)液中加入細(xì)胞破碎液和β-巰基乙醇；所述細(xì)胞破碎液由70mM?Tris和300mM?NaCl組成，余量為水；所述細(xì)胞破碎液的pH值為8.0。

所述細(xì)胞破碎的方法具體可為超聲波破碎；所述超聲波破碎的方法為：超聲強(qiáng)度為30W，超聲環(huán)境為0℃，總超聲時(shí)間為8分鐘，超聲工作方式為每超聲作用5秒鐘間隔7秒鐘。