[發明專利]人Kappa阿片受體1的制備方法

無效

• 申請號: 200910077909.6
• 申請日: 2009-02-03
• 公開（公告）號: CN101497889A
• 公開（公告）日: 2009-08-05
• 發明（設計）人: 劉可為;賴超華;余木;田長麟
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

1、一種制備人Kappa阿片受體1蛋白的方法，包括如下步驟：將人Kappa阿片受體1蛋白的編碼基因插入pET系列載體的多克隆位點，得到含有所述編碼基因的重組表達載體，再將所述重組表達載體導入大腸桿菌BL21中，得到含有所述編碼基因的重組菌，培養所述重組菌，得到人Kappa阿片受體1蛋白。

2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述培養包括如下步驟：將所述重組菌先在37℃條件下培養至菌液的OD₆₀₀值為0.65，再在12℃條件下培養至菌液的OD₆₀₀值為0.95，然后用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導培養。

3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述培養在振蕩條件下進行，所述振蕩的轉速為225轉/分鐘，旋轉半徑為26mm；所述誘導培養的時間為48-60小時。

4、根據權利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述重組表達載體是通過將所述編碼基因插入載體pET21b的多克隆位點得到的；所述編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

5、根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述培養用到的培養基的組成為：Na₂HPO₄?6.0g/L；KH₂PO₄?3.0g/L；NaCl?0.5g/L；蔗糖4.0g/L；NH₄Cl1.0g/L；CaCl₂?0.0111g/L；MgSO₄?0.12g/L；氨芐青霉素50mg/L，其余為水。

6、根據權利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法還包括如下步驟：取權利要求2-5中任一所述方法中所述誘導培養后得到的培養液，將所述培養液中的細胞破碎，棄沉淀取上清液，再進行親和層析過濾，收集洗脫峰，得到人Kappa阿片受體1蛋白；所述親和層析過濾的方法包括如下步驟：依次用洗滌緩沖液1、洗滌緩沖液2和洗脫緩沖液進行洗脫，收集所述洗脫緩沖液洗脫下來的洗脫峰；

所述洗滌緩沖液1包括：0.2％AZ316，20mM?Tris，200mM?NaCl，1.4mM?β-巰基乙醇，其余為水；所述洗滌緩沖液1的pH值為8.0；

所述洗滌緩沖液2包括：0.2％AZ316，30mM咪唑，20mM?Tris，200mM?NaCl，1.4mMβ-巰基乙醇，其余為水；所述洗滌緩沖液2的pH值為8.0；

所述洗脫緩沖液包括：0.2％AZ316，200mM咪唑，20mM?Tris，200mM?NaCl，1.4mMβ-巰基乙醇，其余為水；所述洗脫緩沖液的pH為8.0；

所述百分含量均為質量百分含量。

7、根據權利要求6所述的方法，其特征在于：在所述細胞破碎前，向所述培養液中加入細胞破碎液和β-巰基乙醇；所述細胞破碎液由70mM?Tris和300mM

NaCl組成，余量為水；所述細胞破碎液的pH值為8.0。

8、根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述細胞破碎的方法為超聲波破碎；所述超聲波破碎的方法為：超聲強度為30W，超聲環境為0℃，總超聲時間為8分鐘，超聲工作方式為每超聲作用5秒鐘間隔7秒鐘。

9、根據權利要求6、7或8所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述超聲破碎后、棄沉淀之前還包括如下步驟：向所述培養液中加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶，混勻。

10、根據權利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶后、棄沉淀之前還包括如下步驟：向所述培養液中加入AZ316和β-巰基乙醇，混勻。