[發明專利]一種低產尿素黃酒酵母的篩選方法

有效

• 申請號: 200910077048.1
• 申請日: 2009-01-19
• 公開（公告）號: CN101550401A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 王德良;宋緒磊;張彥青;李紅;王異靜
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12G3/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物與發酵工程領域。涉及一種低產尿素黃酒酵母的篩選方法，可以快速地分離獲得目的菌株，使產尿素低型菌株快速的從大量的處理細胞中分離出來，減少了選育過程盲目性，增強了預見性，大大地提高了育種效率。

背景技術

氨基甲酸乙酯(Ethyl?Carbamate，EC)，具有遺傳毒性和致癌性，是被國際癌癥研究機構(IARC)確認的人類可能致癌物質(2A類)，美國國家毒理計劃將其列入“有理由預料引起癌癥的物質”名單，自2002年以來，氨基甲酸乙酯已成為世界衛生組織重點監控物質之一，但受多方面原因的限制，到目前我國仍沒有制定有關EC的限量標準，造成黃酒、葡萄酒等發酵酒中EC含量超標的問題非常突出，隨著人民生活水平的提高及酒類產品出口的需要，如何降低發酵酒中EC的含量正逐漸受到研究人員的重視。

通過以下三種途徑可以降低黃酒中的氨基甲酸乙酯含量：第一種途徑是添加酸性脲酶使尿素分解為氨和二氧化碳，尿酶純度低是阻礙我國尿酶產業化的主要原因之一。由于尿酶添加劑中含有大量的雜質，添加到酒中會造成二次污染，加大酒類安全風險。第二種途徑是選育低產尿素菌種，利用特殊酵母徹底地清除酒類產品中的尿素，阻止的氨基甲酸乙酯的前體物生成。第三種途徑是適當地控制發酵條件，發酵溫度越高，測氨基甲酸乙酯的生成量越大；隨著P?H值的上升，氨基甲酸乙酯的生成量也趨于升高，因此，控制一定的發酵溫度，可以適當降低酒中氨基甲酸乙酯的含量。在黃酒釀造時，只有選用產尿素低的酵母菌株，才能從根本上解決黃酒中氨基甲酸乙酯含量超標的問題。因此選育低產尿素菌種對于降低黃酒中氨基甲酸乙酯的含量至關重要。

發明內容

本發明的目的是提出一種利用包含刀豆氨酸的培養基篩選低產尿素黃酒酵母方法。刀豆氨酸是一種尿酶抑制劑，本發明利用上述內容并基于精氨酸酶缺陷型菌株可以利用刀豆氨酸作為氮源生長，而非目的菌株則會由于不能利用精氨酸而缺少氮源不能生長的發現，利用刀豆氨酸篩選方法從大量的誘變菌中篩選出產尿素低的酵母菌落，還可以從現有已具有低產尿素性質的酵母中篩選低產性能更好更穩定的酵母。本發明可將上游的菌株改造技術與最終的菌株分離獲得結合起來，在菌體經過改造處理后，可以快速的分離獲得目的菌株，使產尿素低產型菌株快速的從大量的處理細胞中分離出來，減少選育過程盲目性，增強預見性，提高育種效率。

本發明提出的低產尿素黃酒酵母的篩選方法，可由以下步驟組成：

(1)將被篩選酵母培養后接種至含有刀豆氨酸、精氨酸、鳥氨酸的初篩培養基中培養，30℃培養3-4天。生長的菌落可初步定為精氨酸酶缺陷型菌株；

(2)挑取可在初篩培養基上生長的菌落，分別至精氨酸培養基，鳥氨酸培養基的復篩培養基培養；

(3)將初篩培養基中生長出的菌株采用牙簽法分別挑入復篩培養基中，在精氨酸復篩培養基中不能生長而在鳥氨酸培養基中可以生長的菌株即為本發明的低產尿素黃酒酵母菌株。

其中步驟(1)培養基成分及制備方法為：瓊脂培養基：2g瓊脂，2g葡萄糖，50ml超純水在115℃滅菌15min，50℃水浴保溫；氨基酸培養基：刀豆氨酸1mg，精氨酸17.4mg，鳥氨酸66mg，YCB?1.17g，超純水50ml，過濾滅菌，于50℃水浴保溫；將兩種培養基混合后，迅速倒平板，以免凝固，即制得初篩培養基。

步驟(2)精氨酸培養基，鳥氨酸培養基復篩培養基成分為：

a)精氨酸培養基：0.17％不含氮Yeast?Carbon?Base，5mmol/L的精氨酸，2％葡萄糖，2％瓊脂；

b)鳥氨酸培養基：0.17％不含氮Yeast?Carbon?Base，5mmol/L的鳥氨酸，2％葡萄糖，2％瓊脂。

步驟(1)被篩選的酵母可為未經基因修飾的酵母、經過基因修飾的酵母或已具備一定低產尿素性質的黃酒酵母。

為了驗證由本發明方法篩選的低產尿素黃酒酵母菌株，對新獲得的誘變菌株進行發酵培養：挑取上述篩選出的菌種一環；接入10mL大米醪培養液中，30℃培養24小時；再將活化好的試管中菌液全部接入裝有300mL無菌大米醪的三角瓶中，用發酵栓密封，30℃發酵9天，每天稱重，記錄每日失重量，當單日失重量在0.2克以內表明發酵結束。待發酵結束后，檢測發酵液尿素含量。

本發明還提供一株經本發明篩選方法獲得的黃酒酵母，該酵母菌是在篩選獲得多批菌株中，選取篩選后除具備低產尿素的性質外，還保留了原黃酒酵母本身的高酒精耐受力性能，菌種于2009年1月12日保藏到中國微生物菌種保藏管理委員會，保藏號為：CGMCC?No.2858。