[發明專利]一種人胎盤組織液抗炎作用檢測方法

有效

• 申請號: 200910075223.3
• 申請日: 2009-08-20
• 公開（公告）號: CN101629951A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發明（設計）人: 吳廣印
• 申請（專利權）人: 吳廣印
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N1/28;C12Q1/18;C12N5/08
• 代理公司: 邯鄲市久天專利事務所
• 代理人: 薛建鐸

技術領域

本發明涉及一種檢測方法，尤其是一種人胎盤組織液抗炎作用檢測方法。

背景技術

人們都知道人胎盤組織液具有抗炎作用，但是，具體多大濃度的人胎盤組織液才具有治療效果，人們并不清楚，同時，目前人們還沒有掌握人胎盤組織液抗炎作用的檢測方法，這樣，就影響了這種生物藥品的研發和生產。因此，研究一種人胎盤組織液抗炎作用檢測方法，是目前需要解決的技術問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種人胎盤組織液抗炎作用檢測方法。

本發明解決其技術問題的技術方案是：

一種人胎盤組織液抗炎作用檢測方法，其工藝步驟為：①人胎盤組織試驗液的配制，②hPBMC制備，③組織培養液與hPBMC共培養，④ELISA檢測TNF-α及IFN-γ，⑤MTT檢測hPBMC增殖，⑥結果分析。

所述的人胎盤組織試驗液的配制步驟為人胎盤組織原液及用RPMI1640完全培養液2倍、4倍、6倍的進行稀釋，即得人胎盤組織試驗液。

所述的hPBMC制備步驟，即在無菌條件下，預置10?ml?Ficoll分離液于50?ml離心管中。取正常成人供者血液20?ml，以1:2的比例用平衡至室溫的PBS將外周血稀釋，將60?ml稀釋的外周血沿45度傾斜的管壁緩慢加至盛有30?ml?Ficoll分離液的離心管中，在關閉Heraeus離心機機械制動功能前提下，?2000?rpm離心20?min，小心收集界面單個核細胞層至50?ml離心管中，加入PBS至20?ml，1500?rpm離心10?min，洗滌2次，并作細胞計數，以完全培養基（RPMI1640+10%?FBS+1%雙抗）重懸細胞至2×10⁶/ml。

所述的組織培養液與hPBMC共培養步驟，即50?μl?hPBMC(2×10⁶/ml)?和50?μl?PHA混合接種于96孔平底板，然后向其中加入100?μl不同濃度的人胎盤組織試驗液，每組設5個復孔；同時將空白對照組、陰性對照組和陽性對照組接種于96孔平底板，每組設5個復孔，將96孔培養板置于37?℃，5?%?CO₂，飽和濕度的細胞培養箱中孵育72?h。所述的空白對照組為50?μl?PHA與150?μl?RPMI1640完全培養液的混合物，所述的陰性對照組為50?μl?hPBMC(2×10⁶/ml)與150?μl?RPMI1640完全培養液的混合物，所述的陽性對照組為50?μl?hPBMC(2×10⁶/ml)、50?μl?PHA和100?μl?RPMI1640完全培養液的混合物。

所述的ELISA檢測TNF-α及IFN-γ步驟，即將經72?h培養后的96孔板取出，1500?rpm離心10?min，吸取hPBMC細胞培養液上清置于0.5?ml?EP管中，稀釋，分別用人IFN-γ?ELISA?試劑盒、人TNF-α?ELISA?試劑盒檢測IFN-γ及TNF-α含量。

所述的MTT檢測hPBMC增殖步驟，即從培養的hPBMC細胞每孔吸出20?μl上清，加入20?μl?MTT，在細胞培養箱中繼續培養4?h，1500?rpm離心10?min，吸棄培養液上清后每孔加入150?μl?DMSO，微量振蕩器振蕩10?min后用酶標儀于599?nm檢測。

所述的結果分析步驟，即采用SPSS13.0軟件、GraphPad?Prism?5?Demo軟件進行統計學分析。

本發明的有益效果是;

本發明開創了一種人胎盤組織液抗炎作用檢測方法，它對人胎盤組織液抗炎藥的研發與生產奠定了科學基礎。

本發明的目的：實驗研究使用不同濃度的胎盤組織液，在體外對絲裂原激活人外周血單核細胞(hPBMC)增殖以及分泌炎癥因子的抑制作用。

本發明的理論依據：使用不同濃度的人胎盤組織液，與絲裂原激活的hPBMC共培養，經37?℃培養箱培養72?h后，用ELISA試劑盒檢測各組IFN-γ、TNF-α的水平，用MTT法檢測hPBLC增殖情況。