[發明專利]禾本科通用分子標記CNS-AFLP

無效

• 申請號: 200910074076.8
• 申請日: 2009-04-03
• 公開（公告）號: CN101509043A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 刁現民;智慧;李偉;李海權;王永芳;楊璐;劉小靜
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院谷子研究所;中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12P19/34
• 代理公司: 石家莊科誠專利事務所
• 代理人: 劉謨培

技術領域

本發明涉及一種DNA分子標記方法，應用于基因組學、分子生物學和生物信息學三大領域，具體說是涉及一種基于非編碼保守序列(Conserved?NoncodingSequences，CNS)為模板設計引物，進行被測物種PCR擴增，以擴增片段或擴增片段的酶切產物的多態性為標記的分析方法，以及應用此方法開發新型通用型分子標記和分析的技術。

背景技術

DNA分子標記是基因定位、克隆、功能研究和標記輔助選擇育種的基礎。自1980年人類遺傳學家J.G.K.Botstein等首次提出DNA限制性片段長度多態性的分子標記技術以后，1986年第一張番茄RFLP圖譜問世，特別是在PCR技術形成以后，使DNA標記技術成為遺傳研究的熱點，相繼出現了以PCR為基礎的分子標記技術如RAPD、SSR、AFLP等。目前DNA分子標記技術可分為三種類型：以DNA雜交為基礎的技術、以PCR為基礎的技術以及PCR技術和限制性酶切技術相結合的技術。

以DNA分子雜交為基礎的技術主要是RFLP，由于RFLP技術具有大量的內切酶和探針組合，標記數量豐富，同時還具有共顯性、信息完整、重復性和穩定性好等優點，最早被廣泛應用。但RFLP技術分析所用探針的制備經費高、時間長，不同物種需制備不同的探針，還需要進行酶切、轉膜、探針的同位素標記、分子雜交、放射自顯影等繁瑣過程，在以PCR為基礎的技術出現后，RFLP技術應用逐漸減少。

以PCR技術為基礎的標記方法分為隨機引物PCR標記和特異引物PCR標記。隨機引物PCR標記以RAPD技術為主，還包括DAF、AP-PCR技術等。RAPD所用的引物序列是隨機的，揭示的是DNA擴增區段上引物結合位點的堿基序列變異，引物可商品化購買，簡便易行，在研究品種資源系統進化和尋找未知多態性方面應用較多。RAPD的缺點是一般表現為顯性遺傳，提供的信息不完整、不深入，難以區別純合體和雜合體；同時由于RAPD標記所用的引物短，反應易受條件影響，有時帶型不穩定，重復性差，應用受到限制。

特異引物PCR標記包括SSR技術等，所用的引物是針對已知序列的編碼DNA區段設計，引物長度一般為16～24個堿基，穩定性好，結果可靠。SSR的基本重復單元由幾個堿基組成，由于不同基因型間基本單元的重復次數不同而形成多態性。由于SSR位點的兩側序列是保守的，根據兩側序列設計引物來特異擴增SSR序列，就可獲得多態性。與RFLP標記相比，SSR檢測的多態性頻率高，結果穩定可靠，近年來正逐漸取代RFLP。但與RFLP技術類似，SSR操作復雜，尤其是開發SSR引物需要建立DNA文庫、篩選微衛星克隆、測定這些微衛星的兩端序列、設計引物等繁瑣的工作，耗時耗財。雖然一般的實驗室現在可通過Genebank、EMBL和DDBJ等公共數據庫搜索SSR引物，但獲得的信息量往往有限；而且SSR標記多是已編碼區序列設計引物，物種的特異性強，跨物種應用率低，因而限制了該技術的應用。這對于研究基礎相對缺乏的小作物更是嚴重，因此許多小作物沒有SSR標記可用。

Zabeau1993年發明的AFLP方法將酶切和PCR技術相結合，通過對DNA酶切片段的選擇性擴增來檢測酶切片段長度的多態性。AFLP具有RRFLP的可靠性和PCR的高效性，在圖譜構建、資源多樣性分析和基因定位等方面應用多。AFLP的不足是仍需使用同位素標記，污染大，相對較耗時耗財。Konieczny等人將特異擴增片段進行酶切而產生的CAPS標記，實質上是特異引物PCR標記的延伸，增加了發現多態性的機會。綜合現有的分子標記方法，特異引物PCR標記(如SSR等)以及由此延伸的CAPS等，相對比較而言，由于其比較簡便省事省錢，且結果穩定可靠，目前應用較多，也是未來的發展方向，特異引物PCR標記的關鍵是引物設計。

SSR標記設計引物的模板為簡單重復序列兩端的編碼區保守序列，它們多是編碼蛋白的單拷貝序列，雖然不同基因在禾本科不同物種間的保守程度不同，同源性一般為70％左右，它們的堿基序列只是保證功能性的保守，特異PCR擴增要求堿基嚴格配對，因而SSR引物在不同種屬間的通用性就受到了限制，以一個物種基因組為模板設計的SSR引物，較難在其他物種中應用。如刁現民等用72對玉米的SSR引物對谷子等狗尾草屬植物試驗，僅有18對可擴增，不足總量1/3，穩定性不好，多態性也差，因而特異引物PCR標記的SSR引物在不同禾本科植物間的共用性上受到限制。