[發明專利]一種用于升高血小板的融合蛋白及其制備方法

無效

• 申請號: 200910071812.4
• 申請日: 2009-04-17
• 公開（公告）號: CN101863982A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 李鄭武;朱紅杰;王晴;李會成;孫磊;姜媛媛;劉賀煜;冷國慶;陳玉軍;趙華南
• 申請（專利權）人: 哈藥集團生物工程有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12P21/02;A61K38/30;A61P7/00
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技術領域：

本發明屬于生物技術制藥領域，具體涉及一種血小板生成素模擬肽(TMP)及胰島素樣生長因子IGF-I的融合蛋白工程菌的構建以及融合蛋白的制備。

背景技術：

原發或繼發性造血功能障礙，尤其是嚴重血小板減少發生多、危害重、治療難度大，如何促進血小板數量和功能恢復是造血重建領域研究的熱點和難點之一。血小板生成素(TPO)是巨核細胞增殖、成熟和血小板產生的主要調節因子，并且在成熟血小板生成中，TPO的作用強于目前已知的幾種相關造血因子。它通過與其受體c-Mp1結合而刺激巨核細胞增殖與分化，并促進血小板的生成和釋放，控制循環血中血小板的數量和功能。然而作為一個含300多個氨基酸殘基的蛋白質，它也存在著免疫原性強、制備成本高、不能口服以及引起副作用等方面的不足。

1997年美國的Steven等報道利用噬菌體肽庫篩選到一種與TPO無序列同源性而具有與其相似功能的模擬肽。體外實驗顯示這段由14個氨基酸構成的短肽與c-Mp1受體有很高的親和力，具有刺激rhTPO依賴性細胞株Ba/F3/c-mp1的增殖功能。但由于血小板生成素模擬肽(TMP)是14個氨基酸的短肽，在體內不穩定，極容易降解，而且不容易用基因工程的方式制備。

與現有的技術相比較，本發明所提供的融合蛋白其優勢在于，融合蛋白中的IGF-I是一種從血清中發現的具有促進多種細胞生長功能的活性多肽，由70個氨基酸殘基組成的單一肽鏈生長因子組成，其一級結構與胰島素有很高的同源性，屬于同一基因家庭，并且在體內體外都具有部分胰島素的代謝調節功能。經研究表明，IGF是動物生長的直接調節物，能夠刺激多種細胞的增殖與分化，促進蛋白質的合成和結締組織及骨髓的產生。而且IGF-I還能與一些生長因子合用，可促進相應細胞的分化成熟，例如，IGF-I與紅細胞生成素合用，能刺激紅細胞的成熟；與單核粒細胞集落刺激因子合用能刺激粒細胞的生成與成熟。IGF-I刺激RNA，DNA的合成和細胞增殖，特別是對細胞的有絲分裂具有重大意義，其對骨.肌肉、脂肪組織、肝、腎、腦，的生長都有重要作用。

由于IGF-I具有廣譜的促進細胞生長的作用，因此將IGF-I與TMP融合，可通過與TMP受體c-Mp1結合而刺激巨核細胞增殖與分化，并促進血小板的生成和釋放，加強TMP促進血小板生成作用。本發明所提供的融合蛋白分子量小，利用生物技術方法生產成本低，穩定性高，可以通過靜脈、皮下、肌肉、腹腔注射等途徑給藥，與天然TPO比較，具有更好的升血小板的作用。

發明內容

本發明的目的是提供一種融合蛋白，它由TMP及胰島素樣生長因子IGF-I組成。

本發明的融合蛋白其主體部分包括兩部分，其中TMP的氨基酸具有SEQID?NO：1序列；胰島素樣生長因子IGF-I多肽區具有SEQ?ID?NO：2序列。

為了使融合蛋白的兩個主體部分保持各自的完整結構，所述的TMP與胰島素樣生長因子IGF-I多肽區之間用連接肽進行連接，優選的所述的連接肽由0-10個氨基酸殘基組成，更優選0-5個氨基酸殘基組成，實施例中是由Gly-Ser-Gly-Ser-Gly?5個氨基酸殘基組成的短肽。

本發明的融合蛋白具有5種形式，融合蛋白各形式的DNA序列分別為SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、或SEQ?ID?NO：7序列，DNA序列顯示各種形式的融合蛋白中TMP與IGF-I多肽區之間DNA序列使用的是GGT?TCT?GGC?TCT?GGC，本領域技術人員可以選用其他形式的連接肽DNA序列。

本發明的另一目的是提供攜帶本發明融合蛋白DNA序列的重組表達載體。

本發明的融合蛋白是利用基因重組技術制造的。

本發明的融合蛋白根據氨基酸序列，利用氨基酸密碼子的簡并性特點，依據不同表達宿主，包括大腸桿菌、酵母、CHO細胞等多種表達宿主的密碼子偏嗜性，本領域人員可以編碼不同的核苷酸序列，使其在不同宿主內高效表達。本發明所設計的核苷酸序列可以化學合成，也可以采用PCR方法獲得。選擇在大腸桿菌內高效表達的pET系列表達載體，在酵母里表達的pPIC9k表達載體、在CHO細胞內表達的pcDNA3.1表達載體。

在大腸桿菌內pET3a+最適合該融合蛋白的表達、且純化方法也比較簡單，不會存在標簽難以去除的問題。將其構建到表達載體pET3a+上，使其在大腸桿菌內高效表達。其存在形式為包涵體，制備方法為：培養工程菌，離心收集菌體，破菌，收集包涵體，包涵體經洗滌、變性、復性后，分別使用陽離子層析介質和陰離子層析介質進行純化，獲得純度為95％以上的樣品。