[發明專利]一種用于治療鴨病毒性疾病的鴨白細胞干擾素

無效

• 申請號: 200910069135.2
• 申請日: 2009-06-04
• 公開（公告）號: CN101906157A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 王小娥
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: C07K14/555
• 分類號: C07K14/555;A61P31/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于獸藥技術領域，涉及一種治療鴨病毒性疾病的鴨白細胞干擾素的制備方法及其抗病毒活性的測定。

背景技術

隨著國民經濟的飛速發展及農業結構的科學調整，養鴨業成了畜牧業發展速度很快的一個產業。在養鴨業迅速發展的大好背景下，鴨的流動性大大增加，鴨的集約化生產程度進一步提高，鴨疾病對鴨生產所造成的影響變得越來越突出。如何有效防治鴨疾病、減少經濟損失，成為大家非常關心的問題之一。目前，主要是以防疫為手段來控制鴨病毒性疾病的發生。近年來各方面的研究發現，干擾素(病毒的干擾作用是由一種物質引起的，該物質稱之為干擾素)具有抗病毒作用外，還具有抗腫瘤作用，對免疫系統的調節作用和抗細胞等一系列的生理活性，但在獸醫學領域，動物干擾素未能被廣泛應用，主要原因在于目前所獲得的動物干擾素安全性不高，制造工藝復雜，成本高，售價昂貴，效果不顯著，推廣受到限制。

本發明目的是旨在克服上述缺點，提供一種治療鴨病毒性疾病的鴨白細胞干擾素。該鴨白細胞干擾素作為一種廣譜抗病毒藥物，用于治療鴨瘟、鴨病毒性肝炎、鴨源性新城疫、鴨源性減蛋綜合癥等疾病。

干擾素抗病毒具有以下特點：

1、干擾素抗病毒不是殺滅而是抑制病毒，一旦撤去干擾素，病毒往往又重新繁殖。只有用足夠濃度的干擾素，長期使用，才有可能將其徹底消滅。因此干擾素需要長期使用治療。

2、干擾素具有種屬特異性，人干擾素一般只用于治療人的疾病。因此要對抗鴨病毒病就要制備鴨干擾素。

3、不同的細胞種類和不同的動物、不同的病毒感染類型對干擾素的敏感性不同。因此，類型不同的干擾素臨床效果也有所不同。

關于干擾素的研究報道很多，其制備方法已日漸成熟，但由于干擾素具有種屬特異性，針對不同的物種要用相應的干擾素來治療效果最好。同時不同的細胞種類和不同的動物、不同的病毒感染類型對干擾素的敏感性不同。因此，類型不同的干擾素臨床效果也有所不同。要對抗鴨病毒性疾病就要制備鴨干擾素。目前還未見有關利用鴨血制備鴨白細胞干擾素的報道。

因此，提供一種有效預防和治療鴨病毒性疾病的鴨白細胞干擾素的制備方法，是該技術領域科研人員急需開發的新課題之一。

發明內容

本發明的目的在于在現有技術的基礎上改進，提供一種鴨白細胞干擾素的制備方法。

為實現上述目的本發明所采用的實施方式如下：

一種鴨白細胞干擾素的制備及其抗病毒活性的測定方法，其特征在于具體實施步驟如下：

(1)制備鴨血清：無菌采集鴨血，4℃冰箱放置，自然析出，用0.2％CaCl₂處理血漿，除去纖維蛋白，0.22μm過濾除菌，置-20℃保存備用；

(2)制備白細胞：無菌采集健康鴨血，加入100μg/ml雙抗和適量枸櫞酸抗凝劑，4℃冰箱放置；以4000rpm離心30min，收集中層白細胞，灰黃層，用PBS清洗再次離心分離，收集沉淀白細胞，用加了100μg/ml雙抗及上述鴨血清的DMEM培養液稀釋白細胞沉淀物，使白細胞濃度稀釋為1×10⁶/ml；

(3)白細胞懸液中加入效價高的人白細胞干擾素作為啟動干擾素，使培養液中含干擾素抗病毒活性100～500單位/ml，于37℃水浴攪拌培養3～4h；

(4)在啟動的白細胞懸液中加入適量誘生劑鴨源性新城疫病毒(用前在9日齡鴨胚中擴增并測定血凝效價為1∶1280)，使其最終濃度為320血凝單位/ml，37℃水浴搖床培養18～24h；

(5)待干擾素達到最高峰時，離心收集上清，加入鹽酸調至pH2.0～3.0，4℃，放置3～5天，滅活病毒，再加NaHCO₃調至pH7.0～8.0，無菌4℃離心4000rpm30min，收集上清干擾素，除去沉淀及雜質，即得粗制鴨白細胞干擾素；

(6)鴨白細胞干擾素抗病毒活性檢測，主要步驟是：10日齡SPF鴨胚去掉四肢、頭部及內臟，加2倍體積胰酶消化，37℃消化10min左右，等成絮狀時倒掉胰酶，加入DMEM培養基反復吹打，制備DEF，吹打均勻后過濾，取一滴濾液在細胞記數板查看細胞密度，以1×10⁴cells/空密度將DEF鋪于96孔板，每孔100μl，待細胞長成單層后，加入10倍梯度稀釋的鴨白細胞干擾素，37℃、CO₂，作用24h左右，接VSV病毒1000TCID₅₀，37℃、CO₂，培養24h左右，鏡檢陽性對照孔有75％病變，加鴨白細胞干擾素孔有達到及小于50％時，記錄結果。