[發明專利]一種快速高效構建S酵母優良菌株的方法

無效

• 申請號: 200910068602.X
• 申請日: 2009-04-24
• 公開（公告）號: CN101525612A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發明（設計）人: 曹小紅;侯麗華;王春玲;曾斌
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N15/04;A23L1/238;C12R1/645
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明屬于生物技術領域以及食品發酵領域，涉及菌株改造的遺傳操作方法，尤其是一種快速高效構建S酵母優良菌株的方法。

背景技術

高濃度鹽是決定醬油發酵過程后期鹽水發酵過程中的酵母代謝活性的主要因素，因此篩選耐高鹽的S酵母菌株是改善醬油風味、提高醬油質量的重要策略之一。同時，S酵母的大多數與風味相關的特性都是由多基因控制的，這些基因廣泛分布在整個基因組中，人們對之了解很少，因此一般采用全基因組進行改造的方法即基因組重排策略對S酵母進行遺傳修飾方法予以解決。目前，雖然基因組重排技術已經成功地應用到了原核生物及少部分真核生物中，但是真核生物的復雜性使基因組重排技術廣泛應用受到了一定的限制。例如，S酵母比模式生物釀酒酵母的細胞壁還厚，而且S酵母的融合是由MAT等位基因控制等，這些因素導致在S酵母中直接應用由原生質體融合介導的基因組重排的效率比較低。因此，本專利提供了一種由酵母自身的有性重組介導的基因組重排方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用基因組重排策略快速高效構建S酵母優良菌株的方法。

本發明實現上述目的的技術方案是：

一種快速高效構建S酵母優良菌株的方法，其構建方法包括如下步驟：

(1)將S酵母菌株采用EMS進行誘變，以確定最佳的EMS誘變時間；

(2)配制含有各種鹽濃度的選擇平板；

(3)對培養后的S酵母菌株雙倍體細胞進行EMS誘變，處理時長為在上步驟所確定的最佳作用時間，并將誘變后的細胞均勻涂布到含鹽的選擇平板上，經篩選得到S酵母菌株即為原始突變群體；

(4)將原始突變群體進行高效產孢、以及孢子純化；

(5)將純化后的孢子進行充分融合，融合后的孢子在含鹽的選擇平板上進行篩選，將篩選出的所有單菌落作為下一輪基因組重排的母本；

(6)重復步驟(4)、(5)，最后一輪篩選出的單菌落即為S酵母優良菌株。

而且，所述EMS為甲基磺酸乙酯，其體積百分濃度為2％。

而且，所述最佳的EMS誘變時間的確定是采用EMS對5×10⁷個細胞/ml雙倍體S酵母菌株進行隨機誘變，其最佳的誘變時間為60min。

而且，所述的基因組重排的輪數為三輪。

而且，所述的含鹽選擇平板隨著基因組重排次數的增加鹽的濃度逐步提高。

本發明的優點和積極效果是：

1、本發明是在確定甲基磺酸乙酯對S酵母(即醬油企業所用的魯氏酵母)雙倍體細胞最佳作用時間的基礎上，用甲基磺酸乙酯對非傳統酵母菌株S酵母雙倍體進行隨機誘變，產生S酵母遺傳多樣性菌株文庫，通過高效產孢、孢子純化和充分融合的多輪有性重組使文庫中菌株間發生基因組重排，從而構建具有優良發酵性狀的S酵母重組菌株。由此方法構建的重組菌株的耐鹽性得到了明顯的提高，發酵周期縮短了10天，產生的風味物質較野生型菌株明顯改善，而且還產生了重要的風味物質4-EG；特別是4-羥基-2(或5)乙基-5(或2)-甲基-3(2氫)-呋喃酮(4-hydroxy-2(or?5)-ethyl-5(or?2)-methyl-3(2H)-furanone，HEMF)比對照提高了75％，此外還產生了4-乙基愈創木酚(4-ethylguaiacol，4-EG)，而野生型S酵母不能產生4-EG。

2、本發明利用基因組重排策略快速高效構建S酵母優良菌株，該優良菌株在高鹽稀態發酵中能產生醇厚、酯香的醬油風味，具有較好的理化指標(比如氨基酸態氮、總氮、無鹽固形物等)，為醬油的工業生產提供了優良的菌株。

附圖說明

圖1為本發明優良菌株構建方法原理圖；

圖2為本發明重組菌株與對照菌株對其它鹽離子耐性的改善，其中A：YPD平板；B：YPD+0.1mol/l?LiCl平板；C：YPD+3mol/lKCl平板；

圖3為本發明重組菌株與對照菌株醬油發酵結束后的主要風味物質的氣相色譜圖，其中A：重組菌株；B：對照菌株；C：標準樣品。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。

需要首先說明的是：本發明所涉及的S酵母優良菌株，以S酵母野生型菌株(公知菌種，在天津科技大學菌種保藏中心有保藏，任何人通過正常途徑都可以得到)為出發菌株，構建出具有醇厚、酯香的醬油風味、遺傳穩定、發酵周期短等優良發酵性狀的重組S酵母菌株。

一種快速高效構建S酵母優良菌株的方法，步驟是：