[發(fā)明專利]一種糖尿病食療酵母及其構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910068037.7
• 申請日: 2009-03-06
• 公開（公告）號: CN101824388A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明剛;武志強(qiáng);趙磊;廖芳;李娜;馬百成;胡曉宇;王維婧;衛(wèi)一鳴;陳苗;王瑞菊
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;A61K36/064;A61P3/10;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種糖尿病食療酵母及其構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的代謝紊亂性疾病。就糖尿病患病人數(shù)而言，已經(jīng)接近于流行的比例。目前，用于治療2型糖尿病的藥物中，除了磺脲類、二甲雙胍、阿卡波糖以及噻唑烷二酮類等化學(xué)藥物外，還包括肽類藥物胰島素。它們通過不同的機(jī)制來降低血糖，但是這些藥物不能阻止β細(xì)胞的死亡或者促進(jìn)β細(xì)胞的新生。所以，2型糖尿病患者使用上述方法治療，依然無法避免β細(xì)胞功能持續(xù)下降。

胰高血糖素樣肽-1(glucagons-like?pepetade-1，GLP-1)是一種來自腸道L細(xì)胞加工分泌的多肽類激素，有望成為繼胰島素之后又一種治療糖尿病的重要多肽類藥物。研究表明，GLP-1具有增加外周細(xì)胞胰島素受體對胰島素敏感性；改善β-細(xì)胞功能，增加β-細(xì)胞數(shù)量；促進(jìn)胰島素原合成，胰島素分泌，降低血糖和糖化血紅蛋白，抑制胰高血糖素分泌等功能(Endocr.Rev.，May?1，2008；29(3)：367-379，PNAS，September?5，2006；103(36)：13468-13473.，Diabetes?Care，October?1，2004；27(10)：2554-2559，Lancet?2002；359：824-830，Endocrinol，1992，130：159-166，Diabetes，1989，38(3)：338-342，Endocrinology，1995，136：4910-4917，Euro?J?Endocrinol，2000，143：717-725，J?Clin?Invest，2000，105：955-965，Diabetes，1999，48：2270-2276，Endocrinology，2003，144(4)：1444-1455，Endocrinology，2003，144(12)：5149-5158，J?Clin?Invest，1993，91：301-307，Diabetes，1989，38：902-909，Diabetologia，1993，36：741-744，Diabetes，1989，38：902-909)，并且上述功能是血糖依賴性的，不會產(chǎn)生糖尿病治療中最嚴(yán)重的急性低血糖等副作用。但是，由于受到血漿中二肽基肽酶(DPP-IV)降解作用，天然GLP-1在血漿中的半衰期很短，無法實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。因此，眾多研究者采取改變天然GLP-1中受該酶作用的氨基酸位點(diǎn)來抵抗二肽酶降解的策略(No.5118666，WO90/11296，PCT/US89101121)，以延長GLP-1半衰期。

肽類藥物的制備除了化學(xué)合成技術(shù)以外，還可以用DNA重組技術(shù)。據(jù)報(bào)道，已有的利用生物細(xì)胞表達(dá)GLP-1或者GLP-1類似物的專利包括：CN1363654A(利用大腸桿菌包內(nèi)表達(dá)GLP-1(7-36))，CN1865430A(利用畢赤酵母表達(dá)GLP-1類似物)以及US6110703(利用釀酒酵母表達(dá)GLP-1)。

然而，上述表達(dá)策略是針對GLP-1(或者GLP-1類似物)單分子表達(dá)，以及以獲得單分子蛋白為主要目的。本發(fā)明則旨在通過在釀酒酵母中表達(dá)十拷貝串聯(lián)長效胰高血糖素樣肽-1，以提高長效胰高血糖素樣肽-1表達(dá)效率(rolGLP-1)，并最終以口服表達(dá)rolGLP-1的重組釀酒酵母來治療2型糖尿病為目的。此外本發(fā)明利用DNA合成技術(shù)，既將天然GLP-1中的胰蛋白酶水解位點(diǎn)去除又將其中的DPP-IV水解位點(diǎn)去除，這樣既避免了表達(dá)產(chǎn)物在腸道內(nèi)被降解失活的可能，又延長了其在體內(nèi)的半衰期，確保了降低血糖的長效性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是構(gòu)建一種穩(wěn)定表達(dá)長效胰高血糖素樣肽-1的重組釀酒酵母。

本發(fā)明所構(gòu)建的重組釀酒酵母，是將十拷貝串聯(lián)的rolGLP-1編碼基因?qū)脶劸平湍窧J2407，得到穩(wěn)定表達(dá)十拷貝rolGLP-1融合蛋白的菌株；所述rolGLP-1編碼基因的核苷酸序列通過DNA合成技術(shù)將天然GLP-1第8、26和34位氨基酸替換后獲得；所述十拷貝rolGLP-1編碼基因的核苷酸序列是先根據(jù)rolGLP-1編碼基因的核苷酸序列合成兩種類型核苷酸序列以及前后兩種補(bǔ)平用引物片段，進(jìn)而利用合成的核苷酸序列進(jìn)行分步退火一步連接后獲得。十拷貝串聯(lián)的rolGLP-1編碼基因表達(dá)單元的兩端分別連接有選自釀酒酵母核糖體RNA基因(rDNA)序列(GenBank編號為NC001144)29813-30888位以及30889-31728位的核苷酸序列。