[發明專利]實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法及試劑盒

無效

• 申請號: 200910066580.3
• 申請日: 2009-03-02
• 公開（公告）號: CN101514373A
• 公開（公告）日: 2009-08-26
• 發明（設計）人: 孟日增;石建平;肖成蕊;劉晶;趙慶松;劉和平
• 申請（專利權）人: 吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 長春市四環專利事務所
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明屬分子生物學范疇，確切地說是利用熒光PCR技術快速檢測鴨病毒性腸炎的方法及試劑盒。?

背景技術

近十多年來，我國養鴨業獲得迅速發展，據2002年根據聯合國糧農組織(FAO)統計，我國鴨存欄約6.61億只，占世界總量的69.7％，可見我國是第一鴨生產大國。而且以每年10％～15％的速度遞增，新建的大規模養殖場逐漸增多，鴨產品的年產值已經接近300億元人民幣，而且遠銷歐盟、東南亞、日本、韓國等地，隨著國民經濟的進一步發展，鴨產品空間還會不斷擴大，所以養鴨業存在巨大的潛力。但由于各地多渠道引進種鴨或蛋，國內禽產品市場交流頻繁，集約化飼養缺乏管理經驗，防疫工作措施不當，環境污染嚴重，導致鴨的各種疾病不斷發生，而且越來越復雜，但危害較為嚴重的仍為病毒性傳染病，每年引起鴨死亡占到15％～20％，嚴重制約著我國養鴨業的持續穩定發展。?

鴨病毒性腸炎(duck?viral?enteritis，DVE或DPV)，俗稱“鴨瘟”、“大頭瘟”或“爛腸瘟”。是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。是養鴨場的一種最常見的疾病之一，其流行廣泛、傳播迅速、發病率與死亡率極高。每年由于該病的發生引起的死亡、淘汰、產蛋下降，給發病地區的商品肉鴨和產蛋鴨造成很大的損失。?

目前針對鴨病毒性腸炎的診斷方法主要有：病毒分離鑒定、瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附試驗、免疫熒光技術等。?

近年來，隨著現代分子生物學的發展，分子生物學技術已被應用于鴨瘟的快速診斷。國外Plummer等(1998)、Pritchard等(1999)先后應用PCR診斷DPV獲得成功。國內謝芝勛等(2000)首次成功應用PCR診斷鴨瘟。郭霄峰等(2002)、陳建君等(2003)、韓先杰等(2003)、馬秀麗等(2005)、宋涌等(2005)均在鴨瘟病毒DNA不同位點設計相應引物，擴增特異性片段，能以較強的特異性和較好的敏感性快速地檢出鴨瘟病毒。楊發龍(2006)建立了檢測鴨瘟病毒的實時熒光定量PCR方法，用來進行快速診斷、致病機理研究及抗病毒藥物篩選等。湯承(2006)建立了SYBR?Green?I實時定量PCR快速檢測鴨瘟病毒法，檢測鴨瘟標準強毒、疫苗毒及野毒株均為陽性，另外，也根據DPV?UL6，UL7基因的保守序列設計引物和Taqman探針，建立了real-time?PCR檢測鴨瘟病毒方法，來研究DPV在鴨胚中的增殖規律確定合適的收毒部位和收毒時間，并與空斑法定量檢測結果進行了相關行比較，探討了用real-timePCR代替傳統的雞胚法用于疫苗生產中病毒定量檢測的可行性。?

發明內容

本發明的目的是根據保守序列DEVUL31基因設計了引物和Taqman探針，提供一種特異性強，敏感性高，具備快速檢測鴨病毒性腸炎，并能有效應用于口岸和現場檢疫的實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法及成本低、可以商品化的檢測試劑盒。?

本發明實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法引物序列：?

FP??(37421-37440)5′-ACGCTGTCCACGTCAGTTTG-3′?

RP??(37475-37496)5′-TGGCTCATGTTTGGCATTCTAC-3′；?

本發明實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法探針序列：?

probe(37448-37470)5′-FCGGTCGCGCCTCACGACAAGTAP-3；?

所述的探針序列的5′端以FAM(用F表示)標記，3′端以TAQMAN(P表示)標記。?

本發明實時熒光定量PCR快速檢測鴨病毒性腸炎的方法包括以下步驟：?

A、常規方法提取待檢樣品DNA；?

B、將上述的引物和探針與PCR混合液加入PCR反應管中混合后加入待檢樣品DNA；?

C、放入熒光PCR檢測儀中進行反應；?

D、有擴增曲線為陽性，無擴增曲線為陰性；?

步驟B所述的引物FP、RP終濃度均為100nmol/L，探針終濃度為200nmol/L步驟B所述的PCR混合液包括：緩沖液、dNTP和rTaq酶；其終濃度分別為1mmol/L(1×)、0.5mmol/L和rTaq酶為0.05U/μL，待檢樣品DNA溶液占總反應液的10％；?

終濃度是指該物質在PCR總反應液中的含量；?

步驟C按第一階段94℃、5min，1個循環；第二階段94℃、30s，58℃、30s，72℃，30s，各40個循環；?