[發(fā)明專利]雨生紅球藻孢子破壁率的測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910063306.0
• 申請日: 2009-07-24
• 公開（公告）號: CN101609039A
• 公開（公告）日: 2009-12-23
• 發(fā)明（設計）人: 李夜光;耿亞紅;溫小斌
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢植物園
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發(fā)明屬于微藻生物技術領域，更具體設及一種雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)孢子破壁率的測定方法，準確、定量地反映雨生紅球藻孢子粉有效成分蝦青素(Astaxanthin)的生物可利用性，為雨生紅球藻孢子粉生產過程的質量控制和產品流通過程的質量監(jiān)管提供可靠的技術方法。

背景技術

雨生紅球藻(Haematococcus?pluvialis)的孢子(cyst)是自然界含蝦青素(Astaxanthin)最豐富的細胞，含量一般可達干重的1.5-3％，規(guī)模化養(yǎng)殖雨生紅球藻是天然蝦青素的主要來源[魏東，戚曉南.中國海洋藥物.2001，83：4-8]。蝦青素是一種天然類胡蘿卜素，也是用于珍貴水產動物飼料添加劑的主要類胡蘿卜素，具有改善食用魚肉色和觀賞魚外觀色澤的作用，僅三文魚養(yǎng)殖，全球每年就需要大約130噸蝦青素[Bjerkeng?B.In：George?Britton，Synnove?Liaaen-Jensen，Hanspeter?Pfander(Eds)：Carotenoids，Volume?4：Natural?Functions.2008，Basel，P.237-254]。蝦青素具有超強的抗氧化活性，抗氧化能力是天然β-胡蘿卜和維生素E的數(shù)倍，具有極強的去除自由基的能力，保護細胞和組織免受脂質氧化的損傷，顯著提高人體免疫力，具有抗疲勞、抗衰老作用[Guerin，M.et?al.Trends?Biotechnol.2003，21：210-216]。目前，天然蝦青素已經被開發(fā)成為人類的保健食品。大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻生產天然蝦青素是二十一世紀國際上新興的微藻生物技術產業(yè)。近年來，國內也開始批量生產雨生紅球藻孢子粉。

無論作為水產動物的著色劑還是人類的保健食品，雨生紅球藻孢子中蝦青素能否發(fā)揮作用，首先取決于其生物可利用性，即能否被生物吸收利用[Castenmiller，M.；Waet，E.Pure?appl.Chem.1997，69：1245-1250)。雨生紅球藻的厚壁孢子非常堅韌，不易破碎，孢子壁雖然不能阻擋丙酮等小分子有機溶劑的滲透，但是可以完全阻擋蝦青素分子的通過。所以，從紅球藻孢子中提取蝦青素需要首先破碎孢子的細胞壁。據(jù)報道，三文魚缺乏消化紅球藻孢子壁的酶，富含蝦青素、但是孢子壁完整的雨生紅球藻對三文魚沒有著色作用，只有將孢子壁破碎后，才能使三文魚著色(Sommer，R.et?al.Aquaculture.1991，94：79-88)。也就是說，無論動物還是人類，只能利用破壁的雨生紅球藻孢子中的蝦青素。所以，大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻生產天然蝦青素的一個關鍵步驟就是破碎孢子壁。

Mendes-Pinto等研究了高溫(121℃)、酸(0.1M?HCl)、堿(0.1M?NaHO)、酶解(蛋白酶和崩潰酶)、噴霧干燥和高壓均質對雨生紅球藻蝦青素提取的影響，研究表明，不同處理方法，提取效果懸殊很大。此研究僅利用掃描電子顯微鏡對紅球藻孢子破碎情況進行了觀察，未對孢子破壁率進行定量分析[Mendes-Pinto，M.et?al.J.Appl.Phycol.2001，13：19-24]。周湘池等采用勻漿法、凍融法、超聲破碎法、常溫研磨法和低溫研磨法五種破壁方法，從實驗室培養(yǎng)的雨生紅球藻鮮孢子中提取蝦青素。結果表明，不同破壁方法，蝦青素提取率差異很大。這項工作僅測定了蝦青素的提取率，未涉及孢子破壁率的測定[周湘池等.海洋與湖沼，2006，37(5)：424-429]。歐陽琴等以實驗室培養(yǎng)的雨生紅球藻為材料，研究了高壓均質法、超聲破碎法和凍融法對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響，同時測定了蝦青素提取率和細胞破壁率。測定破壁率的方法是：利用“浮游生物計數(shù)框”，在顯微鏡下對破壁處理前的細胞進行計數(shù)，破壁處理后，再對剩余的完整細胞計數(shù)，用公式計算細胞破壁率：R＝(破壁前細胞數(shù)目-破壁后完整細胞數(shù)目)/破壁前細胞數(shù)目[歐陽琴等.福州大學學報(自然科學版)，2005，30(1)：111-114]。

計數(shù)法測定細胞破壁率，需要對比破壁處理前后完整細胞的數(shù)目，僅適用于在破壁處理的同時測定細胞破壁率。雨生紅球藻孢子粉產品離開工廠生產線進入市場后，其破壁率的測定，細胞計數(shù)法就不適用了，因為不可能獲得未破壁處理前孢子數(shù)目的信息。另一方面，在顯微鏡下觀察，有時很難判斷某些細胞是否完整，給細胞計數(shù)法測定破壁率帶來困難。測定孢子破壁率，目的是為了定量反映紅球藻孢子粉中蝦青素的生物可利用性，所以，破壁率的測定方法需要建立在準確測定蝦青素含量的基礎上。