[發(fā)明專(zhuān)利]一種快速篩選高效表達(dá)抗菌肽酵母工程菌的新方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910062860.7
• 申請(qǐng)日: 2009-06-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101643744A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-02-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬向東;胡凡
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/81
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/81;C12N15/64;C12R1/84
• 代理公司: 武漢金堂專(zhuān)利事務(wù)所
• 代理人: 丁齊旭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是生物工程菌高效表達(dá)篩選技術(shù)，特別適用于不能直接利用 功能篩選的多肽、蛋白質(zhì)等表達(dá)產(chǎn)物，或者篩選非常復(fù)雜，需要消耗大量時(shí)間 的表達(dá)產(chǎn)物。特別適合用于大規(guī)模、短時(shí)間內(nèi)、大量地篩選高效表達(dá)抗菌肽的 酵母工程菌。

背景技術(shù)

抗菌肽是宿主防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類(lèi)抵抗外界病原體感染的肽類(lèi)物質(zhì)，是宿 主免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。抗菌肽不僅具有廣泛的抗菌譜，而且有抑制 癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，這使得抗菌肽開(kāi)發(fā)利用成為近來(lái) 的研究熱點(diǎn)。但抗菌肽的開(kāi)發(fā)利用并非易事，抗菌肽天然資源有限，提取非常 復(fù)雜；化學(xué)合成，不但成本很高，還對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染；因此迫切需要一種 廉價(jià)安全的生產(chǎn)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)抗菌肽。基因工程生產(chǎn)方法是滿(mǎn)足這種需要的一種 合適途徑。

目前抗菌肽基因工程表達(dá)主要在大腸桿菌和酵母菌系統(tǒng)中進(jìn)行。酵母菌表 達(dá)體系具有直接分泌抗菌肽的能力，易于直接從發(fā)酵液中分離抗菌肽，相比大 腸桿菌表達(dá)體系更易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；但是由于抗菌肽分子量小(一般小 于5kDa)，表達(dá)效率并不高；如何篩選高效表達(dá)抗菌肽的酵母工程菌成為了抗 菌肽事業(yè)發(fā)展的瓶頸。

在酵母菌中表達(dá)基因工程產(chǎn)物，篩選高表達(dá)的工程菌是個(gè)必不可少的實(shí)驗(yàn) 環(huán)節(jié)，對(duì)于篩選抗菌肽的高效表達(dá)工程菌，通常有兩個(gè)方法，一，由于抗菌肽 有特殊的抗菌活性，故可以采用管蝶法篩選。如果利用管蝶法，那么每次就要 對(duì)成千上萬(wàn)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，先對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選，即先將每個(gè)轉(zhuǎn) 化子都進(jìn)行搖瓶(一般為5-6天)，然后再取發(fā)酵液，利用管蝶法對(duì)發(fā)酵液的抗 菌能力進(jìn)行鑒定，最后將每次篩選得到抗菌活性相對(duì)較高工程菌，再來(lái)進(jìn)行復(fù) 篩，這樣要消耗大量的人力和物力。另外一個(gè)方法就是利用遺傳霉素或者玉米 素等抗生素方法來(lái)篩選多拷貝的酵母菌。酵母分泌載體上一般都有編碼可以分 解這些抗生素的基因，由于酵母分泌載體是整合到染色體上的，理論上如果酵 母菌能夠分解高濃度的抗生素，那么染色體上就存在多個(gè)拷貝的分泌表達(dá)載體， 也就有可能是高產(chǎn)菌，但研究表明能夠在高濃度抗生素上生長(zhǎng)的酵母菌并不直 接與高表達(dá)酵母菌對(duì)應(yīng)，也就是說(shuō)雖然拷貝數(shù)很高，能夠分解高濃度的抗生素， 也不一定是目的產(chǎn)物的高產(chǎn)菌；我們的研究也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中 篩選到一株抗性提高了10倍的酵母工程菌，但抗菌肽的效價(jià)卻沒(méi)有提高。拷貝 數(shù)的多少雖然在理論上與分解抗生素的能力有線(xiàn)性關(guān)系，但是，由于抗生素的 表達(dá)和目的蛋白的表達(dá)并不屬于同一順?lè)醋樱阅康牡鞍妆磉_(dá)量的高低和拷 貝數(shù)并不成線(xiàn)性關(guān)系。本研究采用甘露聚糖酶基因和抗菌肽構(gòu)建成融合蛋白， 使其屬于同一順?lè)醋又校环肿拥母事毒厶敲妇蛯?duì)應(yīng)一分子的融合抗菌肽，這 樣就可以利用甘露聚糖酶的活性來(lái)指示抗菌肽的表達(dá)量，酵母菌在分泌表達(dá)融 合基因的同時(shí)，將融合基因切割成甘露聚糖酶和抗菌肽，這樣用顯色法直接觀 察甘露聚糖酶活的大小，從而直接判斷抗菌肽產(chǎn)生量的多少，這樣就可以初步 快速篩選到產(chǎn)生抗菌肽的高產(chǎn)酵母菌株。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提出一種快速高效篩選高產(chǎn)抗菌肽的酵母工程菌的方法， 該法可直接通過(guò)伴侶蛋白酶活力的大小來(lái)判斷抗菌肽產(chǎn)量的高低，為抗菌肽高 產(chǎn)酵母菌的篩選提供了一個(gè)好方法。

本發(fā)明的步驟為：

1.質(zhì)粒的構(gòu)建，將抗菌肽基因和具有可觀察特征伴侶蛋白基因進(jìn)行融合， 中間添加一個(gè)酵母自生可識(shí)別的切割位點(diǎn)，將融合基因克隆至酵母分泌表達(dá)載 體pHBM905多克隆位點(diǎn)。

2.酶切使質(zhì)粒線(xiàn)性化。

3.電穿孔轉(zhuǎn)化，利用營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選，28℃培養(yǎng)36-48h。

4.根據(jù)酶水解圈的大小，篩選水解圈大的菌落。也就是此次產(chǎn)生抗菌肽產(chǎn) 量高的菌落。

5.將每批篩選到的可能高產(chǎn)菌株集中進(jìn)行復(fù)篩，并驗(yàn)證產(chǎn)生抗菌肽的高產(chǎn) 菌株。

本發(fā)明的基本原理和特點(diǎn)：

本發(fā)明打破了常規(guī)篩選的方法必須經(jīng)過(guò)測(cè)定抗菌肽活性的思路，采取直接 觀察伴侶蛋白對(duì)底物水解的可觀察特征對(duì)抗菌肽產(chǎn)生高產(chǎn)菌株進(jìn)行篩選，節(jié)省 了大量初篩時(shí)間，極大地提高了篩選效益。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，易操作；可把一輪的篩選過(guò)程縮短5-6天。極大減 少人力、物力和財(cái)力的支出。本發(fā)明適合于任何利用功能，就可直接簡(jiǎn)單的進(jìn) 行酶或者蛋白質(zhì)的分辨，用來(lái)指示不易于或者不能采用功能法進(jìn)行直接篩選的 抗菌肽、酶、抗體、多肽等蛋白質(zhì)在酵母中的表達(dá)。