[發明專利]一種高通量的數量性狀調控基因分離的方法

無效

• 申請號: 200910061862.4
• 申請日: 2009-05-04
• 公開（公告）號: CN101544974A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發明（設計）人: 王漢中;華瑋;劉貴華;王新發;劉靜;胡志勇
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體的涉及一種高通量的數量性狀調控基因分離的方法。適用于可通過雜交獲得后代的植物、動物等各類生物，尤其適用于各類作物重要農藝性狀基因的分離。

背景技術

生物的性狀都是由基因控制的，性狀可以被分為質量性狀和數量性狀。質量性狀表現為分離群體中個體的性狀表現呈不連續分布，質量性狀基因也稱為主效基因。因為質量性狀基因控制表型顯著，并且對于某個質量性狀，其控制基因較少，所以克隆方法相對簡單，包括基因定位圖位克隆、突變體分析和近等基因系差異表達基因分離等，目前國內外已有許多通過這些方法克隆質量性狀調控基因成功的范例。

另一類性狀在分離群體中呈連續的分布，只能用數值來衡量其性狀表現，這類性狀稱為數量性狀。農作物的很多重要農藝性狀，如產量性狀、某些品質性狀、對病害的水平抗性和各類環境耐性，一般都表現為數量性狀。數量性狀基因比質量性狀難分離，因為數量性狀往往被多個基因共同作用，難以有效地確定控制性狀表達基因的數目、基因在染色體上的位置以及基因的效應及其作用方式。所以數量性狀調控基因復雜，克隆方法也較繁瑣，目前國內外鮮有成功的例子。

經典的數量性狀基因分離方法只能把控制數量性狀的多個基因作為一個整體進行研究，應用飽和的分子標記連鎖圖譜檢測控制數量性狀的染色體區間，然后分析這段染色體的基因組序列尋找候選基因，最后進行基因的驗證挑選出該數量性狀相關調控基因。具體步驟包括以下：

1)親本的選擇：要求親本在目標性狀上符合研究目的，配制的組合必須是雜交親和。在此基礎上，所選用的親本應該具有足夠的DNA變異。

2)遺傳群體的構建：F2、BC(回交)、加倍單倍體(DH)和重組自交系(RIL)

3)數量性狀座位(QTLs)的定位：選擇多態性好的探針，檢測多態性探針在群體中的表現，構建分子遺傳圖譜。通過統計分析找到與目標性狀連鎖的DNA標記，從而達到定位QTL的目的。

4)基因組人工染色體(BAC)庫的建立：基因組DNA的提取和純化、DNA片段化及末端修補、目標片段的回收及與載體的連接、連接產物的轉化。

5)含QTL位點BAC庫的篩選：將BAC克隆點在膜上，利用某一QTL位點附近的標記制成探針進行雜交，選出帶雜交信號的BAC克隆進行測序分析。

6)候選基因的篩選和驗證：選取上述測序所獲得基因為候選基因，針對基因開展表達分析、與性狀連鎖性分析和轉基因功能驗證，進一步確定目標基因。

該種方法缺點在于：實驗周期長，步驟繁瑣，操作復雜，工作量大，消耗大，并且假陽性高。其中步驟3-5需大量的勞動力及很長的實驗周期，如一個完整的BAC庫的建立就需要半年的時間。該基因分離方法只能針對一個QTL位點，分離存在相同染色體區間內的基因。對于某一數量性狀而言，其QTL位點數量多、分布廣，往往存在幾個不同的染色體區間，如果要分離對應全部有效QTL位點的功能基因得花上5-10年的時間。

另外有一種常用分離數量性狀基因的方法就是首先針對某一性狀經多年回交選育出一系列含不同位點基因的近等基因系，再進行每一對近等基因系功能基因克隆。近等基因系是指除了某一兩個基因外，其他基因都相同的兩個遺傳材料，通常是經過飽和回交形成的除了目標性狀有差異，其他遺傳背景完全相同的兩個遺傳材料。理論上，開展每一對近等基因系研究只能克隆到1個目標基因或位于一個位點的1-2個基因。由于數量性狀含多個功能基因，所以需構建多對近等基因系，并且分別進行研究才能達到分離數量性狀多個基因的目的。該方法存在以下幾個不足之處：1)只能克隆大效應的功能基因，針對小效應的基因位點，因為影響性狀差異不大，從而無法篩選出相應的近等基因系；而數量性狀往往有多個微效功能基因共同影響，所以該方法有一定未知性；2)實驗周期長，僅近等基因系的構建就需要5年左右的時間；3)工作量及工作成本大，針對數量性狀的每一個調控基因均需開展類似重復的研究工作，而數量性狀是多基因控制的，要分離多個基因，工作成本和工作量翻好幾倍。

近年來，也存在一種e-QTL篩選功能基因的方法，該方法以基因表達作為一種標記在相應群體中進行QTL分析，查找候選基因。其存在一個最大的缺點就是人力物力投入巨大，針對群體中每一個個體都必須進行大規模基因表達分析，適用面很窄，只能針對某些模式作物開展研究，這也是該技術沒能廣泛推廣的原因。

發明內容