[發明專利]重組人淀粉樣多肽Aβ42的簡易可溶性表達純化方法

無效

• 申請號: 200910055489.1
• 申請日: 2009-07-28
• 公開（公告）號: CN101967492A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: 蔡建華;鄧益斌;江騰;周平
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C07K14/435;C07K1/22;C07K1/16;C12R1/19
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴;包兆宜

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及疏水性多肽的可溶性表達和純化等技術，具體涉及重組人淀粉樣多肽Aβ42的可溶性表達、純化及鑒定等技術。

背景技術

阿茲海默病(Alzheimer′s?disease，簡稱AD)又稱老人癡呆癥，全世界有2400萬病患，是一種持續性神經功能障礙。最顯著的早期癥狀為健忘，通常表現為逐漸增加的短期記憶缺失，而長期記憶則相對不受病情的影響。隨著病情的加重，病人的語言能力，空間辨別能力，認知能力會逐步衰退。隨著人們生活水平的不斷提高，社會趨于老齡化，阿爾茨海默氏已成為重要的死亡原因。疾病的成因未明，目前沒有準確診斷和有效治療的方法。目前，該疾病的病因和治療方法已成為世界范圍內研究人員關注的焦點。

老年癡呆癥的致病機理目前尚不完全清楚，但普遍接受的觀點是，它與蛋白質錯誤折疊而導致的淀粉樣蛋白聚集沉淀密切相關。1984年Glenner首先從AD患者腦脊液中成功分離出相對分子量約為4.2kD的淀粉樣多肽，并測定了其序列，由于其結構中含大量β-sheet片層，故稱其為β-淀粉樣多肽(β-amyloid，Aβ)。老年癡呆癥的主要特征在病理學上顯示出腦組織萎縮、大腦皮質出現老年斑等現象。研究發現老年斑是Aβ淀粉樣蛋白的沉積所造成。早期的研究認為，根據Aβ淀粉樣蛋白的形成機制及影響因素，設計方案防止淀粉樣蛋白沉積，并清除已形成的斑塊，就可以達到預防和治療老年癡呆癥，然而，最近的老年斑清除藥物的臨床實驗數據表明，老年斑的清除并沒有明顯改善病癥、延長壽命真正對神經細胞起損傷作用的是寡聚的Aβ蛋白。

Aβ多肽來源于β-淀粉樣蛋白前體蛋白(β-amyloid?precursor?protein，APP)，APP經β-及γ-分泌酶酶切生成的一種小肽。該小肽包含39-43個氨基酸殘基，具有很強的疏水性，由42個殘基組成的Aβ42被認為是最容易折疊的，因此Aβ42也被認為是產生老年斑的主要因素。當Aβ42發生聚集時，寡聚體和聚集體可能會引起蛋白質和脂質等生物大分子的氧化，最終引發神經元的凋亡。因此，Aβ42多肽成為老年癡呆癥致病機理和相應治療藥物開發等研究的焦點。

現在，有許多基于抗氧化性和清除金屬離子來抑制Aβ蛋白聚集的方法來開發新藥物的，但是這些藥物是否對改善癥狀有效還不得而知。有些天然藥物，長期以來一直作為中醫治療老年癡呆癥的必需配藥，如姜黃素、兒茶酚等。有資料報道，印度人老年癡呆癥發病率較其他地區偏低，可能與他們長期以姜黃為食用佐料有關。這類天然藥物有效成分多為具有共軛烯酮或酚酮結構的分子，有較強對金屬離子的絡合能力。人們以Aβ蛋白作為研究對象來探索可能的致病因素、尋找可能的藥物，所以有關Aβ的研究首先需要獲得高純度Aβ多肽。

由于Aβ42多肽C末端33-42位氨基酸殘基具有很高的疏水性，直接溶解于水溶液的Aβ42多肽溶解后容易發生聚集，形成不可溶性的沉淀物，這給其合成與純化造成了困難。目前，研究及臨床中應用的高純度Aβ通常是采用化學合成的和基因重組生物合成兩種，但是化學合成方法產率較低、成本昂貴，基因重組表達的方法則難以可溶性表達目標蛋白、效率較低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組人淀粉樣多肽Aβ42的可溶性表達方法。

本發明提供了一種重組人淀粉樣多肽Aβ42的簡易可溶性表達純化方法，包括重組載體構建、轉化與篩選、表達與純化，步驟如下：

(1)將6His-SUMO-Aβ42融合基因的核苷酸編碼序列插入表達載體的多克隆位點，獲得重組表達載體質粒；

(2)將(1)獲得的重組表達載體質粒轉入大腸桿菌表達菌株，得到能與分子伴侶共表達的Aβ42原核表達菌株；

(3)誘導SUMO-Aβ42融合蛋白和分子伴侶的表達，過柱純化。

本發明中，6His-SUMO-Aβ42融合基因可以通過化學合成方法獲得，即跟據其編碼序列，用人工合成方法獲得。例如根據SEQ?ID?NO?3的序列，將核苷酸分子逐個連接，獲得序列如SEQ?ID?NO?3的DNA分子。

6個組氨酸殘基(His)可以簡化SUMO-Aβ42融合蛋白的純化，有利于目標多肽Aβ42的提純。