[發明專利]甲殼素脫乙酰酶的生物制備方法

無效

• 申請號: 200910054879.7
• 申請日: 2009-07-16
• 公開（公告）號: CN101659960A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發明（設計）人: 蔣霞云;鄒曙明
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/80;C12R1/19
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司
• 代理人: 陳學雯

技術領域

本發明涉及生物技術的酶工程領域，更具體地涉及利用基因工程的手段獲得產生甲殼素脫乙酰酶工程菌來制備乙酰酶的方法。

背景技術

甲殼素是一種高分子物質，在自然界的含量僅次于纖維素，全球蝦蟹殼年產量近2,000萬噸。甲殼素不溶于水、稀酸、稀堿和其他有機溶劑，很大程度上限制了其應用范圍。目前應用最多的是甲殼素的脫乙酰衍生物——殼聚糖。

但是，甲殼素脫去乙酰基成為殼聚糖的過程必須要具備濃堿(至少40％以上)和較高溫度(90℃以上)的條件，這不但對生產設備提出了很高的要求，而且遇到了“生產過程中的濃堿如何處理”的難題。據統計我國的甲殼素產量已超過了4000噸大關，市場對甲殼素的巨大需求和甲殼素生產中的嚴重污染之間存在著不可調和的矛盾，針對甲殼素脫乙酰酶的研究便應運而生。

甲殼素脫乙酰酶(chitin?deacetylase，EC3.5.1.41)是一種催化甲殼素分子脫除乙酰基、形成殼聚糖的酶，將這種酶應用于殼聚糖的制備，不僅可以有效地解決目前殼聚糖生產中的環境污染問題，而且可以生產出目前化學法不能生產的、適用于特殊行業(醫藥、環保等)需求的殼聚糖產品，如乙酰基程度均勻、分子量范圍分布窄的殼聚糖產品、以及具有特定乙酰基位置的殼聚寡糖等。但是由于該酶在生物界中并不普遍存在，所以它的來源問題一直困擾著它的應用。圍繞這個問題，主要的研究進展體現在如下方面：

1真菌來源的甲殼素脫乙酰酶

1974年Yoshio最初在接合菌綱的魯氏毛霉中首先發現了甲殼素脫乙酰酶的存在，20年后Kafezopulos采用了硫酸銨沉淀、三次凝膠層析結合的方法分離得到了電泳純的甲殼素脫乙酰酶。以后，研究者們又陸續從犁頭霉、構巢曲霉、黑根霉、短帚霉、灰色小克銀漢霉及啤酒酵母等微生物中檢測到了甲殼素脫乙酰酶活性的存在。

2細菌來源的甲殼素脫乙酰酶

我國學者黃慧莉等在枯草芽孢桿菌中發現了甲殼素脫乙酰基酶活性，并對其酶學特性進行了研究，發現與真菌來源的酶學性質相似。

3病原體來源的甲殼素脫乙酰酶

1990年日本研究者在炭疽病病原菌中較早的發現了甲殼素脫乙酰酶，并用生化分離技術分離得到純度較高的酶，其酶學性質與真菌來源的酶有較大差異。2006年，研究者又在病原菌侵襲內阿衣巴中證實了該酶的存在。

雖然甲殼素脫乙酰酶存在于一些生物體內，但是其含量都是微乎其微的。依靠傳統的生化技術、分離獲得甲殼素脫乙酰酶的主要過程是：從特定的微生物的菌絲體或培養液出發，采用高速離心分離的辦法獲得含有甲殼素脫乙酰酶的粗提取液，再組合使用若干種柱層析分離方法，以獲得純度較高的酶產品。該過程耗時長、得率低，僅能滿足實驗室的需要。所以，用基因工程的方法構建表達該酶的工程菌，為大量、快速生產甲殼素脫乙酰酶提供了一條有效的途徑。

構建酶工程菌株首先需要特定的基因片段。不同生物來源的基因片段往往對基因能否表達、基因的表達形式和基因的表達條件起著至關重要的作用。然而，一旦獲得良好的酶工程菌株，進而采用發酵的方法來獲得生物酶，那么不僅可以解決生物材料來源的問題，還可以大大的簡化費時費力的生物酶純化過程。

為了進一步擴大甲殼素及殼聚糖的應用范圍并保護其知識產權，本領域迫切需要解決甲殼素脫乙酰酶的來源問題，而用基因工程的方法和手段制備生物酶是其先決條件。目前，我國尚無任何關于甲殼素脫乙酰酶制備方法的專利。

發明內容

為了克服傳統的生化技術、分離獲得甲殼素脫乙酰酶的耗時長、得率低，僅能滿足實驗室的需要的缺點，本發明的目的是提供一種可以快速、大量制備甲殼素脫乙酰酶的方法。

本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：

一種甲殼素脫乙酰酶的生物制備方法，它包括下列步驟：

(a)制備含基因序列如SEQ?ID?NO.1所述甲殼素脫乙酰酶的重組表達載體；

(b)制備含有步驟(a)所述重組表達載體的轉化體；

(c)表達和純化甲殼素脫乙酰酶。

在一實施例中，所述步驟(a)如下：

①選取處于對數生長期的總狀毛霉菌絲體為材料，從中抽提總RNA；