[發(fā)明專利]L-苯基乙酰基甲醇的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910054596.2
• 申請(qǐng)日: 2009-07-09
• 公開（公告）號(hào): CN101608191A
• 公開（公告）日: 2009-12-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王志龍;薛迎迎;齊瀚實(shí)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/26
• 分類號(hào): C12P7/26;C12R1/865
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的制備方法，具體是一種L-苯基乙酰基甲醇的制備方法。

背景技術(shù)

麻黃素是一種常用的藥物。獲得麻黃素原料的方法通常有從天然麻黃草中提取、化學(xué)合成和生物合成等途徑。由于天然資源麻黃草生長(zhǎng)受地理位置、季節(jié)等影響，尤其麻黃草為沙漠植物，過度采集對(duì)沙漠地區(qū)的生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重影響，天然資源已經(jīng)十分匱乏。因麻黃素分子存在兩個(gè)手性中心，化學(xué)合成方法也不經(jīng)濟(jì)。利用面包酵母的脫羧酶對(duì)丙酮酸的脫羧反應(yīng)和苯甲醛結(jié)合合成手性苯基乙酰基甲醇。該手性中間體苯基乙酰基甲醇進(jìn)一步經(jīng)化學(xué)合成得到麻黃素是一條在國(guó)外已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)的合成路線。利用面包酵母的脫羧酶對(duì)丙酮酸的脫羧反應(yīng)和苯甲醛結(jié)合合成手性苯基乙酰基甲醇反應(yīng)的特點(diǎn)是：(1)必須利用活細(xì)胞作為生物催化劑，利用活細(xì)胞的代謝產(chǎn)物丙酮酸；(2)利用全細(xì)胞作為生物催化劑，副反應(yīng)多，雖相對(duì)苯甲醛的產(chǎn)物收率只有60％左右，但原料價(jià)格低、工藝簡(jiǎn)單；(3)這類反應(yīng)都是以中等極性或弱極性的有機(jī)化合物作為底物/產(chǎn)物。高濃度的底物/產(chǎn)物將抑制甚至毒害微生物的生長(zhǎng)和活性，這導(dǎo)致常規(guī)的水溶液系統(tǒng)中生物轉(zhuǎn)化過程的產(chǎn)物濃度很低而使其缺乏工業(yè)化價(jià)值。故高產(chǎn)物濃度是該反應(yīng)工業(yè)化追求的主要目標(biāo)參數(shù)。

常規(guī)水溶液中的生物轉(zhuǎn)化因底物/產(chǎn)物的生物毒性而只能在低濃度下進(jìn)行，導(dǎo)致在國(guó)內(nèi)外的微生物轉(zhuǎn)化文獻(xiàn)中除采用復(fù)雜的過程控制技術(shù)外很少有產(chǎn)物超過10g/L的報(bào)道。為了提高催化反應(yīng)的效率，介質(zhì)工程已成為研究的新熱點(diǎn)。其中水-有機(jī)溶劑兩相分配系統(tǒng)被視為一種有效的手段，但生物催化劑在有機(jī)溶劑中，尤其是具有中等極性的有機(jī)溶劑中，生物相容性差，這導(dǎo)致具有中等極性的底物/產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化不能實(shí)現(xiàn)萃取生物轉(zhuǎn)化。

經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，《Wenzhi?Zhang，Zhilong?Wang，WeiLi，Baohua?Zhuang，Hanshi?Qi，Production?of?L-phenylacetylcarbinol?bymicrobial?transformation?in?polyethylene?glycol?induced?cloud?pointsystem.”Applied?microbiology?and?biotechnology.2008，78：233-239》(張文智，王志龍，李薇，張寶華，齊瀚實(shí)，“PEG誘導(dǎo)濁點(diǎn)系統(tǒng)微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-苯基乙酰基甲醇”，《應(yīng)用微生物與生物技術(shù)》)報(bào)道，采用PEG誘導(dǎo)非離子表面活性劑膠束溶液相分離的濁點(diǎn)系統(tǒng)技術(shù)成功地實(shí)現(xiàn)了萃取微生物轉(zhuǎn)化，但存在復(fù)雜的下游分離過程。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種L-苯基乙酰基甲醇的制備方法。本發(fā)明在高底物/產(chǎn)物濃度下，利用活細(xì)胞作為生物催化劑的生物轉(zhuǎn)化過程，以獲得高產(chǎn)物濃度的具有手性結(jié)構(gòu)的重要醫(yī)藥中間體L-苯基乙酰基甲醇。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟：

步驟一，發(fā)酵面包酵母(Saccharomyces?cerevisiae)，獲得酵母細(xì)胞；

步驟二，配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，100ml轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成為：苯甲醛0.9ml、乙醛0.6ml、0.1g?MgSO₄、0.005g?CaCl₂、蛋白胨0～2g、酵母粉0～2g，余量為水；調(diào)節(jié)pH為5.2；

步驟三，取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，每100ml轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基加入如下物質(zhì)：Triton?X-1002～10g，酵母細(xì)胞3～15g，葡萄糖1.2～6g；得混合培養(yǎng)基；

步驟四，培養(yǎng)混合培養(yǎng)基6～24小時(shí)，得到L-苯基乙酰基甲醇。

步驟一中，所述發(fā)酵具體為：發(fā)酵培養(yǎng)基為，100ml培養(yǎng)基的組成為：2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡萄糖，余量為水；30℃下，200rpm的搖床中培養(yǎng)1天。

步驟一中，所述獲得酵母細(xì)胞為，4000rpm離心發(fā)酵液，收集得到酵母細(xì)胞。

步驟二中，所述調(diào)節(jié)pH是利用Na₂HPO₄·12H₂O和檸檬酸進(jìn)行調(diào)節(jié)的。

步驟四中，所述培養(yǎng)具體為：在搖瓶中盛裝為搖瓶容量的10～70％的混合培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

本發(fā)明涉及面包酵母(Saccharomyces?cerevisiae)可通過公開市售的商業(yè)渠道得到，例如產(chǎn)地為湖北武漢的安琪牌面包酵母。

本發(fā)明利用活細(xì)胞的代謝功能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸。在活細(xì)胞中存在丙酮酸脫羧酶實(shí)現(xiàn)丙酮酸脫羧反應(yīng)而產(chǎn)生活性乙醛。活性乙醛和在轉(zhuǎn)化液添加的底物苯甲醛縮合而合成具有手續(xù)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物L(fēng)-苯基乙酰基甲醇。