[發(fā)明專利]黃瓜SNP標(biāo)記及其檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910052887.8
• 申請日: 2009-06-11
• 公開（公告）號(hào): CN101591708A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡潤;李征;潘俊松;何歡樂;曹嫻
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的標(biāo)記及其檢測方法，具體是一種黃瓜SNP(單核苷酸多態(tài)性)標(biāo)記及其檢測方法。

背景技術(shù)

廣義的分子標(biāo)記(molecular?marker)是指可以遺傳并可檢測的特異的DNA序列、RNA序列或蛋白質(zhì)。狹義的分子標(biāo)記僅指DNA標(biāo)記，這一界定標(biāo)準(zhǔn)目前已在世界范圍內(nèi)廣泛采納。分子標(biāo)記是反映DNA分子水平遺傳變異的遺傳標(biāo)記(genetic?marker)。它具有兩個(gè)基本特征，即可遺傳性和可識(shí)別性。DNA分子標(biāo)記的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用對基因定位和基因組作圖的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用，使之成為遺傳學(xué)乃至整個(gè)生物學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。從遺傳學(xué)家Botstein首次提出DNA限制性片段長度多態(tài)性的思想，以及1995年P(guān)CR技術(shù)的誕生至今，已經(jīng)有十幾種基于DNA多態(tài)性的標(biāo)記技術(shù)被建立，這些技術(shù)綜合起來可以分為以分子雜交和限制性內(nèi)切酶技術(shù)為基礎(chǔ)的第一代分子標(biāo)記(如RFLP等)；以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的第二代分子標(biāo)記(如RAPD，SRAP，SSR等)；以及與測序技術(shù)結(jié)合的以單核苷酸多態(tài)性為基因的第三代分子標(biāo)記(如SNP)。同時(shí)，還衍生出以PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶技術(shù)相結(jié)合的分子標(biāo)記(如AFLP，CAPs等)。

單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide?polymorphism，SNP)標(biāo)記技術(shù)最早始于人類基因組計(jì)劃中構(gòu)建高密度人類遺傳圖譜的需要。1998年科學(xué)家首次提出并建立了SNP技術(shù)，目的是檢測人類基因組中單個(gè)核苷酸的變異。SNP標(biāo)記是由DNA序列中因單個(gè)核苷酸的變異而引起的遺傳多樣性，其在所有分子標(biāo)記中數(shù)量最多，密度最高。有報(bào)道稱水稻基因組中平均每1kb基因組序列存在1.70個(gè)SNP潛在位點(diǎn)。因此，SNP標(biāo)記可以極大的增加標(biāo)記數(shù)量，提高用于基因定位和遺傳作圖的標(biāo)記密度。

然而，由于SNP標(biāo)記的開發(fā)和檢測都是已DNA分子測序?yàn)榛A(chǔ)的，由此而來的檢測成本和技術(shù)要求相對較高。在植物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中，特別是在植物分子標(biāo)記基因定位工作中，往往需要構(gòu)建比較大的分離群體(一般均需＞1000單株)，進(jìn)而需要對所有(或部分)單株進(jìn)行標(biāo)記掃描分析。傳統(tǒng)鑒定和檢測方法在這種大通量的分析工作中顯得費(fèi)時(shí)費(fèi)力，高成本。這也在一定程度上制約了SNP標(biāo)記在植物分子遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用。同時(shí)，對一些基因組序列信息并不豐富的植物材料(如本發(fā)明中所使用的黃瓜材料)，SNP標(biāo)記位點(diǎn)的鑒定工作本身也具有一定難度。

因此，發(fā)展SNP標(biāo)記的開發(fā)和檢測的新方法，縮短標(biāo)記的開發(fā)和驗(yàn)證時(shí)間，減少標(biāo)記的檢測成本，是當(dāng)前SNP技術(shù)應(yīng)用于植物分子標(biāo)記定位和大群體掃描的重要問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黃瓜SNP標(biāo)記及其檢測方法。本發(fā)明縮短了SNP標(biāo)記的開發(fā)和驗(yàn)證時(shí)間，減少了標(biāo)記的檢測成本。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一種黃瓜SNP標(biāo)記，具有SEQ?ID?NO：1所示的序列。

所述黃瓜SNP標(biāo)記由SEQ?ID?NO：2所示上游引物和SEQ?ID?NO：3所示的下游引物擴(kuò)增得到。

本發(fā)明涉及還一種黃瓜SNP標(biāo)記的檢測方法，包括如下步驟：

步驟一，選取純合黃瓜親本，對目標(biāo)DNA區(qū)間進(jìn)行測序，確定候選SNP位點(diǎn)；

步驟二，由純合親本雜交獲得F₁代單株，對F₁代單株進(jìn)行步驟一中的目標(biāo)DNA區(qū)間的測序；

步驟三，檢測F₁代測序結(jié)果的峰型圖，確定出現(xiàn)雜合峰的候選位點(diǎn)。

本發(fā)明還涉及一種在黃瓜F₂代分離群體中SNP標(biāo)記的多態(tài)性單株的檢測方法，包括如下步驟：

步驟一，選取純合黃瓜親本，雜交獲得F₁代，F(xiàn)₁代自交得到F₂代分離群體；

步驟二，選取F₂代中隱性表型單株，等量混合其DNA，構(gòu)建隱性基因池；

步驟三，利用SNP引物進(jìn)行擴(kuò)增并測序，檢測測序結(jié)果的峰型圖，當(dāng)出現(xiàn)F₁代測序結(jié)果峰型圖的雜合峰時(shí)，則隱性基因池中含有交換株；

步驟四，對隱性基因池單株分別利用SNP引物進(jìn)行擴(kuò)增并測序，檢測測序結(jié)果的峰型圖，當(dāng)出現(xiàn)F₁代測序結(jié)果峰型圖的雜合峰時(shí)，該隱性單株即為SNP標(biāo)記多態(tài)性單株。