[發明專利]利用快速蛋白質液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法

有效

• 申請號: 200910052722.0
• 申請日: 2009-06-09
• 公開（公告）號: CN101565739A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 朱利民;蘇賽男;聶華麗
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;G01N30/02
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術領域

本發明屬木瓜蛋白酶純度測定領域，特別是涉及一種利用快速蛋白質液相色譜測定木 瓜蛋白酶純度的方法。

背景技術

木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)是一類巰基蛋白酶，廣泛存在于番木瓜(Carica?papaya)的 根、莖、葉和果實內，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富。廣泛地應用于食品行業，如啤 酒的澄清和肉質的嫩化以及皮革、紡織、日化和制藥工業。近年來科學研究發現，木瓜蛋 白酶在醫藥工業中有著巨大的實用價值，含有木瓜蛋白酶的藥物能起到抗癌、抗腫瘤和淋 巴性白血病的作用。由于制藥工業對木瓜蛋白酶的純度要求比較高，如何建立一種快速、 高效又精確地測定木瓜蛋白酶純度的方法，是大家研究的熱點。

目前，最常用的測定木瓜蛋白酶純度的方法是分別測定樣品中木瓜蛋白酶的酶活力和 蛋白質含量后計算樣品的比酶活，這種方法的缺點是酶活和蛋白質含量測定都存在一定得 誤差，能夠測量的木瓜蛋白酶的濃度范圍有限，而且操作步驟繁瑣、重復性差，尤其是當 木瓜蛋白酶濃度過高或過低時，都會產生很大的測量誤差。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種利用快速蛋白質液相色譜測定木瓜蛋白酶純 度的方法，該測定方法快速、操作簡單，耗時少，結果可信，重復性高，為精確測定木瓜 蛋白酶的純度提供依據，具有重要的學術價值和實際應用意義。

本發明的一種利用快速蛋白質液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法，包括：

(1)配制流動相

流動相A溶液：0.02～0.1mol/L?pH?4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；

流動相B溶液：含1.0～2.0mol/L氯化鈉的0.02～0.1mol/L?pH?4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶 液；

(2)制備對照品溶液

將精制木瓜蛋白酶置入50ml容量瓶內，加入流動相A溶液至50ml刻度線定容，搖勻， 至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶對照品溶液；

(3)制備供試樣品溶液

將粗制木瓜粉置于50ml容量瓶中，加入流動相A溶液至50ml刻度線定容，搖勻，經濾 紙過濾，備用；

(4)利用快速蛋白質液相色譜FPLC的離子交換色譜柱進行層析分離，通過計算峰面積比 值的公式來計算木瓜蛋白酶的純度。

所述步驟(1)中的流動相A溶液為0.05mol/L?pH?4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；

所述步驟(1)中的流動相B溶液為含2.0mol/L氯化鈉的0.05mol/LpH?4.5的乙酸- 乙酸鈉緩沖溶液；

所述步驟(2)中的木瓜蛋白酶的用量為250mg-500mg；

所述步驟(3)中的粗制木瓜蛋白酶的用量為300mg-500mg；

所述步驟(4)中的色譜條件是離子交換柱為HiTrap^TM?SP?XL?1ml，流動相A溶液為 0.02～0.1mol/LpH?4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，流動相B溶液為含1.0～2.0mol/L氯化鈉的 0.02～～0.1mol/LpH?4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，上樣量為250～500μl，平衡為5～10個柱床， 沖洗為5～7個柱床，洗脫梯度為流動相B溶液在15～25個柱床內由0％線性增加至 70％-100％，流速為0.8～1.0ml/min；

所述的木瓜蛋白酶的純度計算方法：X＝(粗制木瓜蛋白酶的峰面積×精制木瓜蛋白酶 的濃度/精制木瓜蛋白酶的峰面積×粗制木瓜蛋白酶的濃度)×100％。

有益效果

本發明的測定方法快速、操作簡單，耗時少，結果可信，重復性高，為精確測定木瓜 蛋白酶的純度提供依據，具有重要的學術價值和實際應用意義。

附圖說明

圖1為利用快速蛋白質液相色譜(FPLC)對精制木瓜蛋白酶溶液進行離子交換色譜分析所 得到色譜圖；

圖2為利用快速蛋白質液相色譜(FPLC)對粗制木瓜蛋白酶溶液進行離子交換色譜分析所 得到色譜圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而 不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。

實施例1