[發明專利]一種提高乙型肝炎病毒X蛋白免疫效果的蛋白制備方法

無效

• 申請號: 200910050799.4
• 申請日: 2009-05-08
• 公開（公告）號: CN101880685A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發明（設計）人: 葉榮
• 申請（專利權）人: 上海九諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C12N15/06;C12P21/08;C12R1/19
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技術領域本發明屬于生物技術領域，具體地，涉及一種提高蛋白免疫效果的蛋白制備方法。

背景技術乙型肝炎病毒(Hepatitis?B?virus，HBV)是一種嗜肝DNA病毒，基因組約含有3200個核苷酸，呈雙鏈不完全環形結構。HBV?DNA的短鏈不編碼任何蛋白，長鏈有4個開放性讀框(ORF)，即S區、C區、P區和X區。S區編碼前S1、前S2和S三種外殼蛋白；C區編碼HBcAg蛋白和信號肽；P區基因編碼DNA聚合酶；X區基因的產物是X蛋白。

HBV?X蛋白日益引起人們的重視，有研究發現HBV?X蛋白不僅可以反式激活HBV基因的所有啟動子，也可反式激活宿主的原癌基因，并且X基因與宿主基因組的整合與肝癌的發生有密切聯系。但是在實際研究中尚缺乏特異有效的檢測HBV?X蛋白的抗體，主要原因在于X基因是HBV最小的基因開放讀碼框，編碼的X蛋白僅有16.5kD，非常難以純化，并且在原核表達系統中表達水平也很低，最終其免疫原性非常弱，免疫動物后難以獲得針對X蛋白的特異性抗體。

本發明采用兩個HA標簽串聯兩個X蛋白，成為X-HA-HA-X結構，增加了免疫原的蛋白大小，易于在原核系統中進行表達和純化，同時也豐富了免疫原的空間結構，將純化后的X-HA-HA-X蛋白免疫動物后，再分別用HA-X和pelB-X蛋白篩選抗體，可獲得多個高效價的特異性抗X蛋白單克隆抗體。該方法結果可靠，簡單有效，適用于難以在原核系統表達的低分子量蛋白的表達、純化和抗體制備。

發明內容本發明的目的就是提供一種能簡便、高效地進行HBV?X蛋白在原核系統中的制備工藝。該發明使得X蛋白易于表達和純化，增強了X蛋白的免疫原性，增加了抗X蛋白抗體的多樣性。該發明簡單易行，適用于低分子量蛋白的表達、純化和抗體制備。

本發明的內容主要由三部分組成。

1、融合X-HA-HA-X蛋白、HA-X蛋白、pelB-X蛋白的重組基因構建。

設計X基因上下游引物時，引入HA標簽或pelB標簽的基因，通過聚合酶鏈式反應(PCR)將X基因與HA基因或pel基因連接起來(見說明書附圖1)。通過限制性內切酶將X-HA-HA-X、HA-X、pelB-X分別插入原核表達載體的多克隆位點，測序確認基因序列準確插入。

2、融合X-HA-HA-X蛋白、HA-X蛋白、pelB-X蛋白的原核表達和純化。

按照原核表達系統的操作方法誘導表達X-HA-HA-X融合蛋白，破碎原核細胞，離心后使上清液緩慢通過帶有抗標簽抗體的柱子，目的蛋白被吸附在柱子上，洗去雜蛋白后，洗脫獲得目的蛋白。融合HA-X蛋白和pelB-X蛋白按同樣方法誘導、表達、破碎、離心，取裂解上清液待用。

3、抗HBVX抗體的制備與篩選。

單克隆抗體制備：將融合X-HA-HA-X蛋白與佐劑充分乳化后免疫BALB/c小鼠，2周后加強免疫一次，第4周再免疫一次。拉頸處死小鼠，經75％酒精消毒后，在無菌環境下取小鼠脾臟，將脾臟研碎，過不銹鋼篩網，制備脾細胞懸液。將事先準備好的骨髓瘤細胞與脾細胞按一定比例均勻混合，用聚乙二醇(PEG)溶液融合，用不完全培養液終止融合反應，更換HAT選擇培養液，維持一周后換用HT培養液，維持兩周后，再改用一般培養液，盡量保持每孔有一個克隆細胞群生長，取克隆細胞分泌的上清液進行抗體篩選。

抗體檢測方法：將純化的X-HA-HA-X包被96孔板，加入克隆細胞分泌的上清液孵育1小時后，用PBST洗滌，加HRP標記的兔抗鼠IgG，孵育半小時，用PBST洗滌，加底物顯色，通過酶標儀讀取OD₄₀₅值。

抗體特異性篩選：陽性的單克隆抗體進一步用ELISA或Western?Blot篩選。與HA-X、pelB-X蛋白均有反應的為抗X蛋白陽性克?。慌cHA-X有反應，與pelB-X無反應的為抗HA陽性克隆。只與X-HA-HA-X發生ELISA反應的，是識別空間表位的抗體。

將陽性克隆細胞挑選出來，進行大規模培養，制備腹水，即可獲得大量抗X蛋白抗體。具體實施方式通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出X-HA-HA-X、HA-X、pelB-X基因，插入原核表達載體pET-28a(帶有His標簽)的多克隆位點，測序確認是否正確插入。