[發(fā)明專利]一種無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查21-三體綜合征的試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910038863.7
• 申請(qǐng)日: 2009-04-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101871002A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明;陳華云;陳嘉昌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測(cè)臨床樣品中21號(hào)染色體數(shù)目異常的試劑盒，特別是涉及以多重雜交特異擴(kuò)增技術(shù)通過(guò)檢測(cè)母血漿中胎兒游離核酸多態(tài)性來(lái)實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查21-三體綜合征的試劑盒。

背景技術(shù)

21-三體綜合征是胎兒最常見(jiàn)的染色體病，在新生兒中的發(fā)病率約為1/800，占小兒染色體病的70-80％，發(fā)病率隨著母親年齡的增高而增高。目前我國(guó)大約有100萬(wàn)以上的患者，平均20分鐘就有一例21-三體綜合征患兒出生，全國(guó)每年出生的21-三體綜合征患兒可多達(dá)27萬(wàn)例左右。21-三體綜合征患者由于多了1條第21號(hào)染色體，主要表現(xiàn)為智力低下，發(fā)育遲緩和特殊面容。由于21-三體綜合征給父母、家庭和社會(huì)帶來(lái)了無(wú)可挽回的痛苦和沉重的精神負(fù)擔(dān)，因此對(duì)高齡孕婦等高危人群進(jìn)行產(chǎn)前診斷尤為重要和必要。當(dāng)前在進(jìn)行產(chǎn)前診斷時(shí)，必須采取創(chuàng)傷性的手段獲取胎兒細(xì)胞樣本如羊水或者絨毛組織，盡管這些創(chuàng)傷性的手段相對(duì)比較安全，但是對(duì)胎兒和母親仍然存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，因此臨床上只對(duì)可能懷有遺傳異常胎兒的高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。為了避免潛在的風(fēng)險(xiǎn)，在過(guò)去幾十年中，人們一直廣泛應(yīng)用的方法是從母血中分離胎兒有核紅細(xì)胞，但是由于胎兒有核紅細(xì)胞在母血中含量稀少，需要進(jìn)行細(xì)胞富集等種種操作程序限制了該方法的發(fā)展和實(shí)際應(yīng)用。

2000年，Poon等發(fā)現(xiàn)了母血漿中存在胎兒游離核糖核酸(RNA)。目前研究發(fā)現(xiàn)母血漿胎兒RNA的穩(wěn)定存在可能是由于合體滋養(yǎng)層微顆粒的保護(hù)而避免了血漿中RNA酶的消化作用，同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)是游離胎兒RNA主要的來(lái)源，并且來(lái)源于胎盤(pán)的RNA容易被檢測(cè)到。母血漿中一些胎兒游離RNA同性別無(wú)關(guān)，且母親自身無(wú)表達(dá)，如位于21號(hào)染色體上胎盤(pán)特異表達(dá)的PLAC4基因。由于在一個(gè)正常胎兒，人類染色體的二倍體性使得雜合性SNP(單核苷酸多態(tài)性)其等位基因劑量比例將會(huì)出現(xiàn)1∶1，而對(duì)于一個(gè)21-三體的患兒，其等位基因的劑量比例將會(huì)為1∶2或者2∶1。對(duì)于基因編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)而言，每條染色體上特定基因攜帶的這些SNP位點(diǎn)必將隨著轉(zhuǎn)錄而傳遞到mRNA(信使RNA)上，成為“RNA-SNP”，雜合性的RNA-SNP位點(diǎn)的基因劑量比例也必定符合基因組DNA雜合性SNP劑量的比例情況，因此可以用母血漿中胎盤(pán)表達(dá)的mRNA來(lái)無(wú)創(chuàng)性的評(píng)估胎盤(pán)細(xì)胞染色體數(shù)目異常與否，也就可以評(píng)估胎兒染色體數(shù)目異常與否。

多重雜交特異擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex?Hybri?dization-specific?Amplification，MHSA)，是一種靈敏度極高的相對(duì)定量技術(shù)，它利用核酸雜交、連接反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可以在同一反應(yīng)體系內(nèi)檢測(cè)多達(dá)40個(gè)不同核酸序列拷貝數(shù)變化，最低只需要20ng核酸樣本并且可以檢測(cè)到序列內(nèi)單個(gè)核苷酸的變化，可用瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺電泳或毛細(xì)管電泳等方法進(jìn)行檢測(cè)。

MHSA的原理是將制備的長(zhǎng)型探針和短型探針同目的基因序列雜交，雜交后短探針的5’-端和長(zhǎng)探針的3’-端彼此能夠通過(guò)連接酶連接成一條DNA片段。不匹配的探針雜交后不能被連接酶連接。所有被連接的DNA序列都有共同的5’和3’末端，因此可以僅僅用一對(duì)引物在一個(gè)PCR體系中擴(kuò)增不同的目的基因序列。由于長(zhǎng)型探針有片段大小可變的中間序列，因此每對(duì)MHSA探針組可以擴(kuò)增出特定片段大小的一段序列。通過(guò)電泳的方法即可以分辨出不同的目的基因序列。該技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于染色體疾病、SNP位點(diǎn)檢測(cè)和mRNA表達(dá)研究。

本發(fā)明人應(yīng)用多重雜交特異擴(kuò)增技術(shù)并結(jié)合電泳，通過(guò)精確定量母血漿中胎兒21號(hào)染色體上胎盤(pán)特異表達(dá)的PLAC4的SNP劑量比例，建立一種可以快速、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)性篩查21-三體的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查21-三體綜合征的試劑盒，該試劑盒以多重雜交特異擴(kuò)增技術(shù)(MHSA)檢測(cè)母血漿中胎兒游離核酸，通過(guò)擴(kuò)增21號(hào)染色體特異性的SNP位點(diǎn)，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物劑量的差異分析染色體數(shù)目異常。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案：

(1)設(shè)計(jì)一個(gè)五重復(fù)合雜交-連接-擴(kuò)增體系，以擴(kuò)增染色體特異性的SNP位點(diǎn)；

(2)針對(duì)一組特異性染色體的的SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)和分析；

(3)以電泳法確定擴(kuò)增片段的大小和基因劑量。