[發(fā)明專(zhuān)利]一種大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910037427.8
• 申請(qǐng)日: 2009-02-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101492653A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王健;冉丕鑫;陳豫欽;盧文菊;田艷;陳新宇;賴(lài)寧;萬(wàn)麗梅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州醫(yī)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/06
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/06
• 代理公司: 廣州知友專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 宣國(guó)華

1.一種大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，它包括以下步驟：

步驟1：從腔靜脈組織中分離出中膜組織進(jìn)行消化得到平滑肌細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)， 獲取原代培養(yǎng)的大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞，

步驟2：獲取傳代培養(yǎng)的大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞，

其特征是，所述步驟1從腔靜脈組織中分離出中膜組織的具體過(guò)程為：從腔靜脈組 織中分離出中膜及內(nèi)膜，放入含氯化鈣的HBSS平衡鹽溶液中4℃靜置20～30min，再 放入HBSS平衡溶液中，室溫靜置10～20min；然后取出翻轉(zhuǎn)管壁，使內(nèi)表面朝外，密封 管腔；放入消化液中35～37℃消化3-5min，使內(nèi)膜被消化脫落，去除內(nèi)膜，得到中膜 組織；

所述步驟1平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)過(guò)程為：

a>將中膜組織放入含氯化鈣的HBSS平衡鹽溶液中室溫靜置5-10min，然后用消化 液在35～37℃消化10～15min，吸出消化液，加入混合培養(yǎng)基室溫放置，然后使之成細(xì) 胞懸浮液，靜置至組織塊沉淀，吸出細(xì)胞懸浮液收集另存；再將原消化液加入原離心管 中，重復(fù)上述步驟進(jìn)行再次消化和收集細(xì)胞懸浮液；合并細(xì)胞懸浮液；

b>對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心，棄上清液；經(jīng)PBS清洗后，加入混合培養(yǎng)基，使細(xì)胞 懸浮于培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度并種植于培養(yǎng)板，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)， 3-4天后換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的 大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞；

所述的步驟2的具體操作是：當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到90％融合密度后，用PBS溶液清洗， 加入0.1～0.25％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分鐘，除去胰蛋白酶溶液，清洗細(xì) 胞，加入混合培養(yǎng)液，使細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，然后接種于另一培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，至 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞；

所述的消化液為：含6.9-7.1mg/ml?I型膠原酶、0.3～0.5mg/ml木瓜酶、1.9～ 2.1mg/ml牛血清白蛋白和0.13～0.15mg/ml二硫蘇糖醇的HBSS平衡鹽溶液；

所述的混合培養(yǎng)液為含95～105U/ml的青霉素、95～105U/ml的鏈霉素和10～20％ 胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液；

所述的HBSS平衡鹽溶液為：7.55-7.70g氯化鈉、0.37-0.39g氯化鉀、0.24-0.26g 氯化鎂、1.75-1.85g葡萄糖和2.23-2.25g?HEPES，用水定容至1L；

所述的含氯化鈣的HBSS平衡鹽溶液為：由所述的HBSS平衡鹽溶液與1M氯化鈣溶 液按體積比1∶0.00015-1∶0.00016配制而成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是，所述步 驟a>中混合培養(yǎng)基的用量為3～6ml，室溫放置2～5min；重復(fù)消化中膜組織及收集細(xì)胞 操作2～4次。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是，所述步 驟b>中細(xì)胞密度為1～2×10⁵細(xì)胞/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是，所述的 步驟2中的胰蛋白酶溶液的用量為0.3～0.5ml，胰蛋白酶溶液中含0.02％EDTA；所述 的細(xì)胞接種密度為1～2×10⁵個(gè)/ml。