[發明專利]用于制備抗癌藥物靛玉紅的2-萘酸單加氧酶

有效

• 申請號: 200910036718.5
• 申請日: 2009-01-19
• 公開（公告）號: CN101580821A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 孫國萍;韓木蘭;郭俊;許玫英;岑英華
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12P17/16;A61K31/404;A61P35/00;C12R1/01
• 代理公司: 廣州科粵專利代理有限責任公司
• 代理人: 余炳和

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種2-萘酸單加氧酶在生物催化制備抗癌藥物靛玉紅中的應用，及其經過分子改良的2-萘酸單加氧酶突變體在生物催化制備靛玉紅中的應用。

背景技術：

最近研究證實：很多疾病，包括癌癥、糖尿病、炎癥是由于細胞信號傳導中蛋白激酶紊亂引起的，臨床藥物治療中，藥物作用定位于信號傳導的各個靶位點：癌癥抑制蛋白pRb的CDK介導的磷酸化是有絲分裂周期G1期中必須的，很多人類癌癥就是因為癌癥抑制蛋白pRb及其調節出現了紊亂。因此，環化激酶CDK促進因子成為癌癥治療的有效藥物。靛玉紅是傳統中藥中治療白血病“龍回丸”中藥配方中當歸所含的小分子成分，體外實驗中對CDK有很明顯的促進作用，在中醫中用于治療急性白血病，對核質變化紊亂引起疾病治療效果很好，近年來在美國和日本的臨床治療中發現：靛玉紅對類風濕性關節炎治療和幾種人類腫瘤細胞的生長抑制有明顯的作用。

美國食品與藥品監督局要求制藥公司在新藥的兩種異構體有明顯的藥效和毒理作用差異時，必須以光學純的藥品形式上市。目前，靛玉紅主要從板藍根，大青葉等一些植物中藥中提取獲得的，但是中藥中靛玉紅的含量為＜3mg/g，制品含量低于90％，并且化學提取的步驟繁瑣，成本比較高，藥品純度難以滿足市場需求。

近年來，有機化學品的生物催化方法因其對環境友好，在制藥和化學工業中需求越來越大。生物催化化學物質轉換已經受到廣泛重視，它是替代傳統的化學合成有效方法，同時有利于解決合成過程中出現的難題。有機合成中，生物催化專一性強，反應條件溫和。酶的手性催化有立體和結構域的特異性，其反應速度快、酶的底物范圍廣；同時，通過酶基因工程，可以進一步改善酶的穩定性、提高反應底物特異性、甚至改變其映像專一性。采用生物技術手段，改變酶分子結構，給傳統生物催化帶來了機遇和挑戰。采用生物催化，可以合成復雜的大分子，同時生產過程對環境友好，天然的酶和改造的酶都可以通過DNA重組技術在適當的宿主內大量生產，因此，化學合成中酶的應用給化學和制藥工業的進步帶來了巨大的機會。

本發明申請人在生物基因工程研究中，提出一種制備降解2-萘酸活性的DNA片段的方法：從2-萘酸降解菌伯克霍爾德氏菌(Burkholderia?sp.JT1500)菌株中提取總DNA，經限制性內切酶部分水解，得到DNA片段，將其連接到pUC18載體并轉化大腸桿菌HB101獲得含有一段8050bp長度的，上有2-萘酸單加氧酶基因簇和輔酶A連接酶基因的DNA片段，上述序列已經在CN1618971A公開，并且該專利文件的序列表中的序列1中的第2793-3951位的1158bp的核苷酸序列為2-萘酸單加氧酶基因，編碼的2-萘酸單加氧酶如該份專利文件的序列表的序列2所示。

本發明申請人(2-萘酸單加氧酶基因(nmo)的克隆及表達，方向平，丘曉穎，岑英華，孫國萍，微生物學報，第43卷第5期，第599～605頁，2003年10月)通過酶切連接將Burkholderia?sp.JT1500的一段DNA片段(4802bp)亞克隆到載體pUC18上，得到了重組子pEK123，測序后的pEK123重組子4802bp插入片段的序列已經登陸公開于歐洲EMBL基因庫，序列號為AJ566333，該片段是上述專利文件公開的8050bp中的最前面的4802序列，該序列含有編碼黃素還原酶NmoB和2-萘酸單加氧酶NmoA的堿基序列，其中從重組子pEK123中PCR擴增出的上述專利公開的1158bp的2-萘酸單加氧酶基因(在EMBL基因庫接受號為AJ566333的序列的2793-3951位)編碼的酶是含黃素還原酶的單加氧酶家族(FMO)中的一個新成員，與其他已登錄的單加氧酶基因序列同源性較低，是一個新的單加氧酶，該基因編碼的酶能對2-萘酸發生加氧轉化。李小波和岑英華(2-萘酸單加氧酶基因及NADH：黃素還原酶基因的克隆分析，李小波，岑英華，孫國萍，微生物學報，第45卷第4期，第557～560頁，2005年8月)研究發現該2-萘酸單加氧酶能夠催化吲哚產生靛藍。

發明內容：

本發明人通過對重組子pEK123的DNA片段進一步的研究，發現了另外一個開放閱讀框，該開放閱讀框位于pEK123的重組DNA片段上，EMBL基因庫中AJ566333序列的2579-3892位，共1314bp，編碼437個氨基酸，并且發現該開放閱讀框編碼的酶能夠催化吲哚產生靛玉紅，證明其是一個具有功能的基因，該開放閱讀框與本發明人團隊以前發現2-萘酸單加氧酶基因具有部分重疊序列。