[發(fā)明專利]櫟枯萎病菌的巢式PCR檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910034195.0
• 申請(qǐng)日: 2009-09-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101691605A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳翠萍;陳貫源;粟寒;李彬;鄭斯竹;安榆林;葉建仁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

1.一種櫟枯萎病菌的巢式PCR檢測(cè)方法，提取櫟枯萎病菌樣品的DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫涮卣魇牵O(shè)計(jì)鑒別櫟枯萎病菌的特異性引物CF01/CF02，其序列為：

上游引物CF01：5’-GGCAGGGACTTCTTTCTT-3’；

下游引物CF02：5’-AAGGCTTGAGTGGTGAAA-3’；

利用通用引物ITS1/ITS4和特異性引物CF01/CF02，進(jìn)行櫟枯萎病菌的Nested?PCR擴(kuò)增，所述通用引物ITS1/ITS4的序列為：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；

擴(kuò)增步驟如下：

第一輪擴(kuò)增：通用引物PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系總體積為25μl，反應(yīng)組分為：10×的反應(yīng)緩沖液2.5μl，25mM的MgCl₂2.5μl，2.5mM的dNTP?2.5μl，10μM的上下游引物ITS1/ITS4各1μl，5U/μl?Taq?DNA聚合酶0.25μl，模板櫟枯萎病菌樣品DNA提取液1μl，滅菌水補(bǔ)足25μl；擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)擴(kuò)增95℃180秒，接著94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒，20個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸300秒；

第二輪擴(kuò)增：特異引物PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系總體積為25μl，將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍，取1μl作為模板，其它反應(yīng)組分：10×的反應(yīng)緩沖液2.5μl，25mM?MgCl₂2.5μl，2.5mM?dNTP?2.5μl，10μM的上下游引物CF01/CF02各1μl，5U/μl?Taq?DNA聚合酶0.2μl，滅菌水補(bǔ)足25μl；擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)擴(kuò)增95℃180秒，接著94℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，35個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸300秒；

擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)：

取8μl第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用1.5％(質(zhì)量/體積)瓊脂糖凝膠，在電壓150V下電泳30分鐘，之后置于EB內(nèi)染色20分鐘，取出，于凝膠成像系統(tǒng)下拍照檢測(cè)，如果存在280bp的DNA特異性條帶，則確定所檢測(cè)的病菌為櫟枯萎病菌。