[發明專利]櫟枯萎病菌實時熒光PCR檢測方法

無效

• 申請號: 200910034194.6
• 申請日: 2009-09-02
• 公開（公告）號: CN101701247A
• 公開（公告）日: 2010-05-05
• 發明（設計）人: 吳翠萍;陳貫源;李彬;粟寒;鄭斯竹;安榆林;葉建仁
• 申請（專利權）人: 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/645
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

技術領域

本發明涉及櫟枯萎病菌實時熒光PCR檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

櫟枯萎病是由櫟枯萎病菌(Ceratocystis?fagacearum)所引起的主要危害櫟屬樹種的一種真菌病害，目前分布于北美的美國，加拿大以及歐洲的歐洲的保加利亞、波蘭、羅馬尼亞等國，國內尚未發現。

櫟枯萎病(Ceratocystis?fagacearum)，1942年首先在威斯康辛州洲發現，造成當地紅櫟的迅速死亡。此后該病害不斷蔓延，目前美國中東部地區的20多個州都已有發現，已成為美國國內櫟樹類樹種的主要毀滅性病害。在危害嚴重的威斯康星州和明尼蘇達州每年有成千上萬的櫟樹枯死。目前，它已被我國，歐盟(EU)和歐洲植保組織(EPPO)各成員國列為檢疫性有害生物。

該病原菌短距離傳播主要通過病健根的嫁接，還能通過媒介昆蟲在地面進行傳播，其中最主要的是露尾甲和小蠹蟲。病菌的遠距離傳播則主要通過帶菌的苗木及潮濕的櫟樹原木或其產品的長途運輸來進行。近年來，我國從美國，加拿大等疫區進口苗木及木質包裝的數量急劇上升，因此，在這些植物性材料中極有可能攜帶著病原菌，且我國的寄主分布與生態氣候條件都很利于該病菌的定殖擴散，面對如此嚴峻的形勢，我們應盡快的建立一套快速、靈敏、可靠的檢測方法，避免該病菌的侵入從而給我國森林資源和林業生產所造成的巨大損失。

迄今為止，世界上對于櫟枯萎病菌的分子檢測方法報道的較少，1999年，R.C.WITTHUHN等人建立了PCR-RFLP技術來區分長喙殼屬一些重要種的系統發育關系，其中也包括了C.fagacearum，但是該方法成本高，過程復雜，檢測靈敏度低難以定量，且對于樣品DNA的純度要求比較高，故不適宜在各檢疫口岸推廣和應用。

近年來，越來越多的研究者采用分子生物學的方法來檢測林木病原菌。利用細胞核內或線粒體內rDNA為檢測位點的PCR技術在真菌鑒定的不同分類水平上都有著廣泛的應用。其中核糖體基因上的一部分，轉錄間隔區(ITS1和ITS2)由于在種內比較保守，但在種間存在多態性，此外，由于細胞核內或線粒體內rDNA是多拷貝即使樣本DNA量很少或質量并不高的情況下也可以擴增出應有的產物，所以目前很多分子檢測方法的建立都是基于這一位點。而關于櫟枯萎病菌的實時熒光PCR(Real-time?PCR)檢測方法，甚至其它分子檢測方法，國內外均未有報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種適宜于檢疫口岸使用的櫟枯萎病菌的實時熒光PCR(Real-time?PCR)檢測方法，以便于快速、靈敏、準確地對口岸苗木及木質包裝進行櫟枯萎病菌的檢測。

本發明從病菌的菌絲、土壤或木塊等樣品中提取病菌的DNA，以樣品DNA作為模板，進行櫟枯萎病菌的Real-time?PCR檢測。

檢測方法如下：

①.提取櫟枯萎病菌待檢樣品的DNA，低溫冷凍保存備用；

②.根據GeneBank公布Ceratocystis屬的ITS區域序列的差異(登錄號：EU918711，AY528959，DQ318196，AY214001，U75626，U75627，EF042612，EF190968，AY233924，FJ347031，AY233921，DQ318195，EU245018，AY528999，DQ074743，DQ074742，DQ318203，AY821864，AF043607，U75630，DQ318198，EF042613，DQ318202，AY528973，AF275495，DQ318205，U75621，EF408554，AY529004，AY907044，AY907036，DQ061281)，利用引物設計軟件(Primer?Premier5)，設計一對能鑒別櫟枯萎病菌的特異性引物CF01/CF02，其序列為：

上游引物CF01：5’-GGCAGGGACTTCTTTCTT-3’；

下游引物CF02：5’-AAGGCTTGAGTGGTGAAA-3’；

③.利用特異性引物CF01/CF02，以及熒光染料SYBR?Green?I進行櫟枯萎病菌的Real-time?PCR擴增，擴增步驟如下：