[發明專利]櫟枯萎病菌實時熒光PCR檢測方法

無效

• 申請號: 200910034194.6
• 申請日: 2009-09-02
• 公開（公告）號: CN101701247A
• 公開（公告）日: 2010-05-05
• 發明（設計）人: 吳翠萍;陳貫源;李彬;粟寒;鄭斯竹;安榆林;葉建仁
• 申請（專利權）人: 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/645
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

1.櫟枯萎病菌實時熒光PCR檢測方法，其特征是包含如下步驟：

①.提取櫟枯萎病菌待檢樣品的DNA，低溫冷凍保存備用；

②.設計一對能鑒別櫟枯萎病菌的特異性引物CF01/CF02，其序列為：

上游引物CF01：5’-GGCAGGGACTTCTTTCTT-3’；

下游引物CF02：5’-AAGGCTTGAGTGGTGAAA-3’；

③.利用特異性引物CF01/CF02，以及熒光染料SYBR?Green?I對樣品DNA進行擴增：

擴增反應體系包含基因組DNA?1μl、10μM的上、下游引物CF01/CF02各0.4μl、SYBR?premix?Ex?Taq(2×)0.4μl、Rox?DyeII0.4μl，滅菌水補足20μl；

以上體系預擴增95℃30秒，接著95℃3秒，60℃延伸25秒，共40個循環，在每個循環的延伸階段同步多次采集熒光；立即進行熔解曲線分析，程序為：95℃，1min；60℃，1min；從60℃開始每升高0.5℃保持10s，連續升高70次，直到95℃為止；

④.擴增結果分析

PCR擴增結束后利用ABI?7500Fast熒光定量PCR儀自帶的分析軟件，對得到的擴增圖譜和融解曲線進行分析，如果擴增圖譜有出現明顯的“S”形曲線，且融解曲線中的Tm吸收峰值與陽性對照一致，則說明所檢測的病菌樣品為櫟枯萎病菌。

2.根據權利要求1所述的櫟枯萎病菌實時分子檢測方法，其特征是將已知濃度的櫟枯萎病菌樣品的DNA以10倍的梯度依次稀釋成標準的梯度溶液，再分別按所述反應體系進行擴增，經儀器自帶的軟件得出一個標準線性曲線，根據標準線性曲線的函數關系，推算出已檢出櫟枯萎病菌的樣品中的DNA量。